內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中益生酵母菌的篩選及其對Cheddar干酪質(zhì)構(gòu)的影響

劉敏，曹志軍，蘇杰，李艷梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程技術(shù)系，內(nèi)蒙古，包頭014109)

0 引 言

內(nèi)蒙古地區(qū)地域遼闊，蒙古族畜牧養(yǎng)殖業(yè)具有非常悠久的歷史，養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展豐富了傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，如酸奶、馬奶酒、成熟及半成熟干酪等產(chǎn)品的加工，傳統(tǒng)乳制品中孕育著極其豐富的、多樣性的微生物菌群[1]。由于蒙古族地域差別和制作工藝的多樣化，在不同地區(qū)干酪成熟過程中微生物菌群多樣性構(gòu)成與干酪質(zhì)構(gòu)的形成密切相關(guān)[2]。最近發(fā)現(xiàn)有些酵母菌對人體存在益生作用，應(yīng)用其益生特性加工乳制品不僅會對產(chǎn)品風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生影響，而且也可有效抑制有害菌的生長繁殖。有研究表明，有些酵母菌不會對乳制品的品質(zhì)造成負(fù)面影響，相反，還會對發(fā)酵乳制品提供有益作用，并且對干酪的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)形成起到非常重要的影響[3]。在干酪成熟過程中，酵母菌可發(fā)酵利用葡萄糖等單糖類產(chǎn)生CO2氣體，這也是干酪形成孔狀結(jié)構(gòu)的必要條件，同時，酵母菌對一些腐敗微生物和腐敗梭狀芽孢桿菌的生長同樣具有抑制作用；并且可使多種有機物質(zhì)分解產(chǎn)生多種水溶性維生素，使乳制品的營養(yǎng)價值顯著提高；除此以外，酵母菌還具有預(yù)防和治療急性痢疾、降低機體膽固醇、抗氧化和抗輻射等益生活性作用[4]。因此，從原料乳中篩選出益生酵母菌進而應(yīng)用于乳品生產(chǎn)中具有重要意義。

近年來，大量的酵母菌應(yīng)用于軟質(zhì)干酪的研究，但對于硬質(zhì)干酪中酵母菌特性、對干酪品質(zhì)影響研究很少，其中質(zhì)構(gòu)是影響消費者購買干酪最關(guān)鍵品質(zhì)之一。質(zhì)構(gòu)是指通過視覺或聽覺利用機械、觸覺感受到的產(chǎn)品所具有的流變和結(jié)構(gòu)上的屬性的變化程度[5]。本實驗將分離篩選的益生酵母菌用于cheddar干酪生產(chǎn)中，研究其在成熟過程中對干酪質(zhì)地的影響，評價其作為cheddar干酪附屬發(fā)酵劑的可實現(xiàn)性，為發(fā)掘傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中具有特殊作用的酵母菌資源提供依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基、革蘭氏染液，杭州微生物制劑有限公司；直投式干酪發(fā)酵劑（50U），丹尼斯克公司；凝乳酶，科漢森公司。

TA.XT-2i型質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Microsystem公司；S-3400N掃描電子顯微鏡，日本日立公司；AC－S型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PHSJ－3F型p H測試儀，雷磁。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離

1.2.1.1 試驗樣品采集

從內(nèi)蒙古的阿拉善、伊盟、錫盟和通遼等地區(qū)采集傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品15個，標(biāo)號記錄采樣地點后封口低溫4℃儲存，帶回實驗室盡快進行酵母菌的分離。

1.2.1.2 樣品中酵母菌的分離

參考文獻[6]的方法：通過稀釋法將樣液涂布于YPD培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，挑取單個菌落進行革蘭氏染色，重復(fù)幾次純化酵母菌，鏡檢結(jié)果為同一細胞形態(tài)后，將其接種于YPD液體培養(yǎng)基中，純培養(yǎng)物中加入30%的滅菌甘油，混勻后在-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 潛在益生酵母菌的篩選

1.2.2.1 耐酸試驗

測定篩選菌株的酸耐受性，試驗調(diào)配培養(yǎng)基的p H值為（1.5、2.0、3.0、5.0和6.5），在不同p H值條件下測試32株酵母菌的耐酸能力。菌株活化后制得菌懸液，在5種不同p H值的液體篩選培養(yǎng)基中加入4%的菌懸液[7]，取p H值7.0為空白對照。在30℃溫度下，轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h后測定OD600nm吸光度。

1.2.2.2 耐膽鹽試驗

將以上篩選酸耐受性較好的酵母菌，接種在含豬膽鹽質(zhì)量濃度為0%、0.2%、0.4%、0.6%的固體膽鹽培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)12 h，采用菌落平板計數(shù)法計算活菌數(shù)[8]。觀察接種酵母菌株在不同膽鹽濃度下其生長狀況，膽鹽的耐受能力計算公式表示為：耐受性（%）=ΔE/ΔF×100；ΔF：測定對照培養(yǎng)基中細胞增長量，ΔE：測定添加膽鹽培養(yǎng)基中細胞增長量。

1.2.2.3 模擬人體溫度下的生長測試

將篩選菌株的懸液接種到Y(jié)EPD固體培養(yǎng)基上，每株菌做3次平行實驗，在搖床（180 r/min），溫度37℃條件下培養(yǎng)24 h，采用活菌平板計數(shù)法進行計數(shù)。

1.2.2.4 模擬人體胃液環(huán)境

以上試驗篩出的酵母菌活化后，抽取25 mL酵母菌純培養(yǎng)物在37℃、3 000 rpm下離心10 min，取其菌懸液，所得細胞用無菌PBS緩沖溶液(0.1 mol/L,p H為7.0，其中NaCL濃度為80 g/L)按1:9比例進行稀釋。取0.1 m L懸浮液添加到1.0 m L模擬胃液（5 g/L NaCL和3 g/L胃蛋白酶)中,加HCL調(diào)節(jié)p H值為1.2,混合物在37℃,150 r/min搖床上培養(yǎng)2 h后，在600 nm時測其OD值，通過濁度變化測其菌數(shù)，計算方法表示為：菌數(shù)降低率（%)=（OD末-OD初）/OD初×100；OD初：對照組的初始吸光值，OD末:模擬胃液中的吸光值[9]。

1.2.3 切達干酪生產(chǎn)工藝流程

對經(jīng)過益生篩選得到的酵母菌進行活化，使菌株活性達到107cfu/mL以上，切達干酪經(jīng)上述工藝加工，在堆釀完成后將凝塊切碎、添加適量酵母菌液，菌液添加量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，與不添加酵母菌的空白對照。干酪壓制成形，成熟后測定其質(zhì)構(gòu)變化情況。

1.2.4 成熟期間干酪質(zhì)構(gòu)測定

加工好的干酪，分別抽取成熟0、15、30 d樣品，在室溫下放置2 h后，將樣品切為2.00±0.04 cm左右的正方形，利用質(zhì)構(gòu)儀（QTs25）進行TPA分析。測定條件為：溫度19±2℃，樣品溫度10±0.5℃。測量參數(shù)：探頭類型為P/5，觸發(fā)力為0.2 N；下壓變形為10 mm；測試速率為5 mm/s；質(zhì)構(gòu)儀前探頭下降速率為2 mm/s；測量探頭回程速率為2 mm/s。樣品放置在平衡盤上進行測定，結(jié)果取3次平均值[10]。

1.2.5 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSSl3.0軟件，通過方差分析(ANOVA)法對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌分離菌株的菌落形態(tài)及細胞形態(tài)特征

從內(nèi)蒙古15份傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品中分離到的32個優(yōu)勢菌株，菌落形態(tài)呈圓形，表面光滑濕潤，顏色呈乳白色，表面凸起、邊緣整齊、不透明。顯微鏡下美藍細胞染色觀察為藍紫色，形態(tài)呈現(xiàn)圓形、橢圓形、卵圓形等形狀，以一端出芽的方式芽殖，細胞形態(tài)均符合酵母菌特征。

2.2 益生菌篩選試驗

對篩選32株酵母菌進行益生性篩選實驗發(fā)現(xiàn)，在不同p H值條件下，（X 4和Y2）菌株均能夠正常生長，且生長活性較高，在高酸（p H=1.5）條件下,測定其吸光值均高于0.4，在此條件下，酵母菌細胞均能存活，表明這2株菌具有較好的耐酸特性。在膽鹽含量濃度達到1 g/L條件下，（X 4和Y2）菌株增長率分別達到13.68%、6.05%，而在5 g/L膽鹽下增長率分別為13.01%、3.03%，增長率略微下降，說明X 4和Y2在5 g/L膽鹽下具有一定的生長力、耐受性。在模擬胃液中培養(yǎng)4 h后，X 4和Y2株酵母菌數(shù)量略微降低，有較好的耐膽鹽性，具有一定的存活性。菌株耐溫性實驗中，（X 4和Y2）菌株在37℃恒溫培養(yǎng)24 h，2株酵母菌生長正常，結(jié)果顯示37℃條件菌株生長不受影響。經(jīng)過以上多條件篩選試驗后得出：X 4和Y2菌株具有潛在益生功能。觀察其菌落形態(tài)及其結(jié)構(gòu)形態(tài)，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 X4酵母菌菌落形態(tài)及細胞形態(tài)

圖2 Y2酵母菌菌落形態(tài)及細胞形態(tài)

2.3 不同抑菌膜包裝Cheddar干酪質(zhì)構(gòu)的變化

添加X 4和Y2株菌制得Cheddar干酪，貯藏在4℃條件下，取成熟0、15、30 d的樣品，與未添加酵母菌樣品干酪進行對照，測定其質(zhì)構(gòu)的變化，表1中列出了不同成熟期干酪TPA檢驗的質(zhì)構(gòu)參數(shù)。

表1 添加X 4和Y2菌株Cheddar干酪的質(zhì)地隨成熟時間的變化情況

干酪的質(zhì)構(gòu)特征表現(xiàn)受干酪的成熟度、成份組成、組織結(jié)構(gòu)以及各分子間的拉伸力等因素影響，質(zhì)構(gòu)通常是用來表征干酪成熟期間變化的重要指標(biāo)[11]。從表1可見，添加X 4和Y2菌株后，Cheddar干酪的硬度隨著成熟時間的延長而降低，且X 4菌株Cheddar干酪組硬度大于Y2菌株Cheddar干酪組，成熟時間對硬度的影響極顯著（P＜0.05）；各處理組黏著性和彈性的數(shù)值是逐漸上升的，且空白組上升參數(shù)最大，Y2菌株Cheddar干酪組次之，X 4菌株Cheddar干酪組上升最小，其差異性均顯著（P＜0.05）；凝聚性、膠性、咀嚼性和回彈性在貯藏期間都呈下降趨勢，凝聚性空白組較大，X 4菌株Cheddar干酪組最小，各組隨著貯藏時間的延長，其變化不顯著（P＞0.05）；膠性在7 d時較大，14 d后下降趨于平緩，且X 4菌株Cheddar干酪組較大，統(tǒng)計分析顯示膠性在整個成熟期內(nèi)差異顯著（P＜0.05）；咀嚼性和回彈性Y2菌株Cheddar干酪在7 d時較大，14 d后每組下降趨于平緩，成熟期內(nèi)差異性顯著（P＜0.05）。

3 結(jié) 論

從內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選得到32株酵母菌，對其進行了益生性能篩選試驗，測定其在不同p H（1.5～6.5）值條件下、不同膽鹽濃度范圍（0%～0.6%）、模擬人體胃液和模擬人體溫度條件37℃測其細胞數(shù)和OD值進行了耐受性益生性分析，最后篩選得到2株(X 4和Y2)存活率較好的潛在益生酵母菌。后續(xù)利用酵母菌與乳酸菌共生發(fā)酵作用制作Cheddar干酪。在不同成熟階段利用質(zhì)構(gòu)儀分析了干酪質(zhì)構(gòu)變化情況，結(jié)果顯示，隨著干酪成熟時間的延長，X 4菌株對干酪硬度影響較大；Y2菌株對黏著性和彈性影響顯著；2株菌均對膠性、咀嚼性、凝聚性和回彈性影響顯著。