半夏瀉心湯調(diào)控Shh信號通路對BMSCs外泌體誘導(dǎo)的人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖的影響

崔國寧，劉喜平，李沛清，王慶苗，戴麗蓉，王宇，朱中博，董俊剛

半夏瀉心湯調(diào)控Shh信號通路對BMSCs外泌體誘導(dǎo)的人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖的影響

崔國寧，劉喜平，李沛清，王慶苗，戴麗蓉，王宇，朱中博，董俊剛

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

觀察半夏瀉心湯對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）外泌體誘導(dǎo)的人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖的影響，探討其相關(guān)作用機制。利用Transwell小室將BMSCs外泌體與BGC-823細(xì)胞進(jìn)行非接觸共培養(yǎng)，實驗分為空白組、模型組、陽性對照組和半夏瀉心湯高、中、低劑量組，熒光染料Dil標(biāo)記BMSCs外泌體，激光共聚焦顯微鏡觀察BGC-823細(xì)胞對BMSCs外泌體的攝取，計算平均光密度（MOD）；實時無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)檢測細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；RT-qPCR檢測Shh、Ptch1、Smo、Gli1及C-myc mRNA的表達(dá)。與空白組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)可見大量紅色熒光標(biāo)記，MOD值顯著增加（＜0.05）；模型組20～50 h細(xì)胞指數(shù)（CI）顯著增加（＜0.05），G1、G2期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例升高（＜0.05），Shh、Smo、Ptch1、Gli1及C-myc mRNA表達(dá)顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，半夏瀉心湯各劑量組紅色熒光標(biāo)記減弱，其中半夏瀉心湯高、中劑量組MOD值明顯減少（＜0.05），半夏瀉心湯各劑量組20～50 h CI顯著減少（＜0.05），G1、G2期細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例降低（＜0.05），Shh、Smo、Ptch1、Gli1及C-myc mRNA表達(dá)顯著降低（＜0.05）。半夏瀉心湯可抑制BMSCs外泌體誘導(dǎo)的BGC-823細(xì)胞增殖，其機制可能與下調(diào)Shh、Smo、Ptch1、Gli1及C-myc mRNA表達(dá)，抑制Shh信號通路有關(guān)。

半夏瀉心湯；人胃癌細(xì)胞；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；外泌體；Shh信號通路

胃癌是常見的惡性腫瘤，居全球腫瘤性死亡病因的第2位[1]。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌發(fā)生發(fā)展與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）有關(guān)[2]。胃癌前病變期，BMSCs可歸巢至胃黏膜部，參與胃黏膜修復(fù)，與胃上皮細(xì)胞融合轉(zhuǎn)化為胃癌細(xì)胞[3]。胃癌發(fā)生后，BMSCs可歸巢至腫瘤部位，成為腫瘤微環(huán)境的重要細(xì)胞成分[4]，促進(jìn)腫瘤的生長[5]。課題組前期研究表明，胃癌微環(huán)境中BMSCs可惡性轉(zhuǎn)化，有明顯促瘤作用[6-7]。外泌體是微環(huán)境中細(xì)胞間傳遞生物信息物質(zhì)的重要載體，腫瘤微環(huán)境中BMSCs能分泌更多外泌體[8]，BMSCs促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖與其外泌體具有明顯相關(guān)性[9]。Shh信號通路是影響細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵信號通路，而BMSCs外泌體可激活Shh信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖[10]。但BMSCs外泌體促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長增殖機制仍不十分清楚。課題組前期研究表明，半夏瀉心湯對胃癌荷瘤裸鼠有明顯抑瘤作用[11]，也可抑制人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖[12-13]，同時對胃癌微環(huán)境中BMSCs的惡變促瘤有明顯抑制作用[14]。本研究旨在觀察半夏瀉心湯對胃癌細(xì)胞攝取BMSCs外泌體的影響，探討半夏瀉心湯調(diào)控BMSCs外泌體誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞增殖的作用機制，以期揭示其防治胃癌的新靶標(biāo)。

1 實驗材料

1.1 動物及細(xì)胞株

8周齡雄性SD大鼠40只，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（甘）2015-0002，動物使用許可證號SYXK（甘）2019-0002。大鼠飼養(yǎng)于溫度23～25 ℃、相對濕度40%～60%的SPF級實驗室。本研究涉及動物的實驗均經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查批準(zhǔn)（2018-009）。BGC-823細(xì)胞，重慶威斯騰生物科技公司提供。大鼠BMSCs來源外泌體，重慶威斯騰生物科技公司提取鑒定，濃度為100 μg/mL。

1.2 藥物

半夏瀉心湯（法半夏12 g，干姜9 g，黃芩9 g，黃連3 g，人參9 g，大棗4枚，甘草9 g），飲片購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，按原方稱取飲片，混合并浸泡30 min，煎煮2次，第1次加8倍量水，煎煮1.5 h，第2次加6倍量水，煎煮1 h，合并煎液離心，過濾，濾液減壓分別濃縮至含原藥材2.700、1.350、0.675 g/mL，得半夏瀉心湯高、中、低劑量湯劑。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清、無外泌體血清、DMEM高糖培養(yǎng)基，美國Gibco公司，貨號分別為HLC0101、10828-028、11995-065；MTT試劑盒，英國Abcam公司，貨號20140165；DAPI染色液，上海碧云天生物科技有限公司，貨號C1005；細(xì)胞膜紅色熒光探針（Dil），美國Sigma公司，貨號41085-99-8；GANT 61，美國MCE公司，貨號HY-13901；DEPC，美國Sigma公司，貨號D5758；RNA提取試劑盒，日本Takara公司，貨號9767；引物、RT-PCR試劑盒、SYBR GREEN Ⅰ，重慶威斯騰生物科技公司。熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司，型號ECLIPSE Ti-s），流式細(xì)胞檢測儀（美國Beckman公司，型號CYTOFLEX），細(xì)胞功能分析儀、檢測板（美國xCELLigence公司），0.4 μm、8 μm Transwell小室（美國Costar公司），實時熒光定量PCR儀（美國ABI StepOne Plus公司，型號Stepone plus），電泳儀（美國Bio-Rad公司，型號DYCP-3I DN），Tanon 2500R凝膠成像儀（上海Tanon公司），CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）。

2 實驗方法

2.1 半夏瀉心湯藥物血清制備

參考前期研究方法造模[15]，大鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按隨機數(shù)字表法分為正常組及半夏瀉心湯高、中、低劑量組，每組8只，實驗前禁食不禁水12～24 h。按人與動物體表面積折算等效劑量，半夏瀉心湯高、中、低劑量組分別給予相應(yīng)劑量湯劑灌胃，每次2 mL，每日2次。正常組給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)2周。末次灌胃后1 h，大鼠麻醉開腹，腹主動脈收集全血，靜置分層后3 000 r/min離心10 min，收集血清，于56 ℃水浴滅活30 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 MTT法篩選半夏瀉心湯藥物血清最佳濃度

將BGC-823細(xì)胞以5×104個/孔接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，同時每孔加入0.1 mL濃度為100 μg/mL的BMSCs外泌體，分別設(shè)空白對照組及5%、10%、15%半夏瀉心湯高劑量藥物血清組，每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入含正常對照血清及5%、10%、15%半夏瀉心湯高劑量藥物血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入100 μL MTT（5 mg/mL），37 ℃孵育4 h，吸去上清液，每孔加入200 μL DMSO，震蕩10 min，酶標(biāo)儀參比波長設(shè)為620 nm，測定波長495 nm處各孔OD值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）＝藥物血清組OD值÷空白對照組OD值×100%。每個樣品計數(shù)4次并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。通過細(xì)胞存活率計算半數(shù)抑制濃度（IC50），確定半夏瀉心湯藥物血清的最佳濃度。

2.3 分組及共培養(yǎng)體系建立

利用Transwell小室將BMSCs外泌體與BGC-823細(xì)胞進(jìn)行非接觸共培養(yǎng)。實驗分為空白組、模型組、陽性對照組和半夏瀉心湯高、中、低劑量組。各組上室加入1.5 mL BGC-823細(xì)胞懸液（2×105個/mL，DMEM培養(yǎng)基∶雙抗＝90∶1），模型組及空白組上室加10%正常對照血清，半夏瀉心湯高、中、低劑量組上室分別加對應(yīng)的10%藥物血清，陽性對照組上室加含20 μmol/L GANT 61（Shh通路阻斷劑）的10%正常對照血清。下室加無外泌體血清培養(yǎng)液（DMEM培養(yǎng)基∶無外泌體血清∶雙抗＝90∶10∶1），模型組、陽性對照組和半夏瀉心湯高、中、低劑量組下室加100 μg/mL的BMSCs外泌體1 mL。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)檢查。

2.4 BGC-823細(xì)胞攝取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體觀察

采用熒光活性染料Dil標(biāo)記BMSCs外泌體。將BMSCs外泌體與Dil按1 000∶1比例混合，避光放置30 min，100 000×、4 ℃離心90 min，PBS重懸后再次超速離心，棄上清液，獲得Dil標(biāo)記的BMSCs外泌體，加入“2.3”項下模型組、陽性對照組和半夏瀉心湯高、中、低劑量組下室內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取BGC-823細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定，PBS清洗，常溫爬片15 min，PBS洗3次×10 min；滴加DAPI染液，避光孵育15 min，PBS洗4次，每次5 min；抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)紅色熒光表達(dá)，并用Image Pro Plus 6.0軟件分析紅色熒光的平均光密度（MOD）。

2.5 BGC-823細(xì)胞增殖水平檢測

取“2.3”項下共培養(yǎng)48 h的BGC-823細(xì)胞，消化成細(xì)胞懸液，移至離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，備用。設(shè)置細(xì)胞功能分析儀程序：進(jìn)行基線測量后，每隔10 min檢測1次細(xì)胞指數(shù)（CI），記錄細(xì)胞生長過程。在E-Plate 16檢測板孔中加50 μL培養(yǎng)基，將檢測板置于工作站上進(jìn)行系統(tǒng)掃描，取出檢測板，孔中分別加入各組BGC-823細(xì)胞，數(shù)量為2 000個/孔，置于超凈臺中室溫放置30 min，將檢測板放到培養(yǎng)箱中，工作站上實時動態(tài)檢測約50 h，觀察BGC-823細(xì)胞增殖水平，并計算CI值。

2.6 BGC-823細(xì)胞生長周期檢測

取“2.3”項下共培養(yǎng)48 h的BGC-823細(xì)胞，消化成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液移至離心管，2 000 r/min離心5 min，PBS洗2次，相同條件下再次離心后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，4 ℃預(yù)冷后置于70%乙醇中固定過夜，隨后1 000 r/min離心5 min，加1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再次離心后棄上清，各組加4.7%PI染液0.5 mL，重懸細(xì)胞后，37 ℃溫浴30 min，4 ℃避光存放，流式細(xì)胞術(shù)檢測BGC-823細(xì)胞生長周期，計算G1、G2、S期細(xì)胞比例。

2.7 RT-qPCR檢測BGC-823細(xì)胞Shh、Ptch1、Smo、Gli1及C-myc mRNA表達(dá)

取“2.3”項下共培養(yǎng)48 h的BGC-823細(xì)胞，PBS洗1次，4 ℃、8 000×離心2 min，棄上清，細(xì)胞中加入適量Buffer RL，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，隨后合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：30 ℃、10 min，42 ℃、60 min，95 ℃、5 min，冰上冷卻。擴增條件：50 ℃、2 min，95 ℃、2 min，95 ℃、2 s，60 ℃、1 min，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量。引物序列由重慶威斯騰生物科技公司合成，見表1。

表1 各基因PCR引物序列

基因名稱引物序列（5’～3’）產(chǎn)物長度/bp GAPDHF：AGATCCCTCCAAAATCAAGTGG252 R：GGCAGAGATGATGACCCTTTT ShhF：ATGACTCAGAGGTGCAAAGACAAG206 R：CCACGGAGTTCTCTGCTTTCA Ptch1F：CCATTTCTTGCCCTTGGTGT 82 R：TCCTCTTATTCTGTCCCGTTTCA SmoF：GCCTTGATGGCTGGAGTAGTGT120 R：GAGCAGGTGGAAATAGGATGTCTT Gli1F：CTCGACCTGCAAACCGTAATC223 R：GAAGCATCATTGAACCCTGAGTAG C-mycF：CCTCCCGCTGACCCAACAT112 R：TGTCCTGGCTCGCAGATTGT

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 半夏瀉心湯藥物血清最佳濃度篩選

與空白組比較，各濃度半夏瀉心湯高劑量藥物血清組BGC-823細(xì)胞存活率明顯下降（＜0.05，＜0.01）。第48 h，10%半夏瀉心湯高劑量藥物血清組BGC-823細(xì)胞存活率接近50%，故將10%半夏瀉心湯藥物血清濃度作為最佳濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。結(jié)果見表2。

4.2 半夏瀉心湯對BGC-823細(xì)胞攝取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的影響

與空白組比較，模型組BGC-823細(xì)胞內(nèi)可見大量紅色熒光標(biāo)記，MOD值顯著增加（＜0.05）；與模型組比較，半夏瀉心湯高、中、低劑量組BGC-823細(xì)胞內(nèi)紅色熒光標(biāo)記減弱，MOD值減少，其中半夏瀉心湯高、中劑量組最顯著（＜0.05）。見圖1、表3。

表2 不同濃度半夏瀉心湯高劑量藥物血清對不同時點BGC-823細(xì)胞存活率的影響（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05，**＜0.01

圖1 各組BGC-823細(xì)胞攝取BMSCs外泌體形態(tài)

表3 各組BGC-823細(xì)胞攝取BMSCs外泌體水平比較（±s）

注：與空白組比較，#＜0.05；與模型組比較，*＜0.05；與半夏瀉心湯低劑量組比較，△＜0.05

4.3 半夏瀉心湯對BGC-823細(xì)胞增殖水平的影響

0～20 h，各組BGC-823細(xì)胞CI無明顯變化（＞0.05）。20～50 h，與空白組比較，模型組BGC-823細(xì)胞CI顯著增加（＜0.05），與時間呈正相關(guān)（2＝0.952 8）；與模型組比較，半夏瀉心湯高、中、低劑量組BGC-823細(xì)胞CI均顯著減少（＜0.05），其中半夏瀉心湯高劑量組最顯著。見圖2。

圖2 各組BGC-823細(xì)胞增殖水平比較

4.4 半夏瀉心湯對BGC-823細(xì)胞生長周期的影響

與空白組比較，模型組G1、G2期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例明顯升高（＜0.05）；與模型組比較，半夏瀉心湯高、中、低劑量組G1、G2期細(xì)胞比例明顯升高，S期細(xì)胞比例明顯降低（＜0.05）；與半夏瀉心湯低劑量組比較，半夏瀉心湯高劑量組S期細(xì)胞比例明顯降低（＜0.05）。見表4、圖3。

表4 各組BGC-823細(xì)胞生長周期比較（±s，%）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05；與半夏瀉心湯低劑量組比較，△＜0.05

圖3 各組BGC-823細(xì)胞生長周期檢測

4.5 半夏瀉心湯對BGC-823細(xì)胞Shh、Smo、Ptch1、Gli1、C-myc mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組BGC-823細(xì)胞Shh、Smo、Ptch1、Gli1、C-myc mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；與模型組比較，半夏瀉心湯高、中、低劑量組BGC-823細(xì)胞Shh、Smo、Ptch1、Gli1、C-myc mRNA表達(dá)明顯降低（＜0.05）；與半夏瀉心湯低劑量組比較，半夏瀉心湯高、中劑量組BGC-823細(xì)胞Shh、Gli1 mRNA表達(dá)明顯降低（＜0.05），半夏瀉心湯高劑量組BGC-823細(xì)胞Smo、Ptch1、C-myc mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。見表5。

表5 各組BGC-823細(xì)胞Shh、Smo、Ptch1、Gli1、C-myc mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05；與半夏瀉心湯低劑量組比較，△＜0.05

5 討論

腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞（間充質(zhì)干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）、細(xì)胞外基質(zhì)及生長因子、細(xì)胞因子及其他小分子等共同構(gòu)成的復(fù)雜動態(tài)環(huán)境系統(tǒng)[16]。研究表明，腫瘤微環(huán)境中的非腫瘤細(xì)胞及非細(xì)胞成分在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[17]。BMSCs參與腫瘤微環(huán)境的構(gòu)成，是腫瘤微環(huán)境中的重要非細(xì)胞成分之一[18]。

既往研究認(rèn)為，腫瘤微環(huán)境中的各種細(xì)胞通過產(chǎn)生多種生長因子和蛋白水解酶調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境，或激活腫瘤基質(zhì)細(xì)胞而活化腫瘤基質(zhì)，活化的腫瘤基質(zhì)細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，通過體液彌散方式直接作用于腫瘤細(xì)胞。但隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的外泌體在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞間信號傳輸，促進(jìn)腫瘤發(fā)展惡化方面具有重要作用[19]。外泌體可富集、包裹細(xì)胞外的miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子等多種生物信息物質(zhì)，并保護(hù)其免受環(huán)境降解，從而將生物信息物質(zhì)以胞吞的形式傳遞至受體細(xì)胞，并被受體細(xì)胞攝取、內(nèi)化后激活胞內(nèi)信號通路對受體細(xì)胞進(jìn)行多途徑、多位點的精細(xì)調(diào)節(jié)[20]。本研究表明，BMSCs來源的外泌體能被BGC-823細(xì)胞攝取，提示BGC-823細(xì)胞是BMSCs外泌體的靶細(xì)胞之一。

Shh信號通路主要由sonic hedgehog配體（Shh）、跨膜受體蛋白Patched 1和Patched 2（Ptch1、Ptch2，主要為Ptch1）、G蛋白偶聯(lián)受體樣蛋白Smoothened（Smo）及下游核轉(zhuǎn)錄因子蛋白Gli（Gli1、Gli2和Gli3，主要為Gli1）組成。生理情況下，Shh信號通路處于失活狀態(tài)，可維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及其正常分化增殖。而異常激活的Shh信號通路通過激活下游癌基因，造成細(xì)胞過度增殖[21]。Shh信號通路的激活起始于Shh與Ptch1的結(jié)合，進(jìn)而激活Smo，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子蛋白Gli1表達(dá)。Gli1是hedgehog信號通路激活的重要標(biāo)志，可進(jìn)一步激活下游C-myc等靶標(biāo)基因[22]。C-myc為8號染色體癌基因，是腫瘤細(xì)胞過度增殖惡化的重要標(biāo)志[23]。本研究結(jié)果顯示，BGC-823細(xì)胞攝取BMSCs外泌體后Shh信號通路Shh、Ptch1、Smo、Gli1及C-myc mRNA水平升高，提示細(xì)胞生長增殖能力明顯增強；而以Shh信號通路阻斷劑GANT 61（陽性對照組）干預(yù)后，Shh、Ptch1、Smo、Gli1及C-myc mRNA水平明顯下降，表明BGC-823細(xì)胞生長增殖能力明顯減弱，從而說明激活Shh信號通路能促進(jìn)BGC-823細(xì)胞生長增殖。

胃癌屬中醫(yī)學(xué)“積聚”“反胃”等范疇。半夏瀉心湯出自《傷寒雜病論》，方中法半夏、干姜辛開以化痰散結(jié)，黃連、黃芩苦降以清解癌毒，人參、大棗、甘草甘補健脾補虛。全方辛開、苦降、甘補配伍，兼顧虛實，共奏健脾補虛、化痰散結(jié)、清解癌毒之功。本研究結(jié)果表明，半夏瀉心湯能抑制BMSCs外泌體誘導(dǎo)的BGC-823細(xì)胞生長增殖，下調(diào)Shh信號通路Shh、Ptch1、Smo、Gli1及C-myc mRNA表達(dá)，提示半夏瀉心湯抑制BMSCs外泌體誘導(dǎo)的BGC-823細(xì)胞增殖與阻斷Shh信號通路有關(guān)。

本研究從外泌體途徑初步闡明了BMSCs促進(jìn)胃癌惡化進(jìn)展的機制，揭示了半夏瀉心湯抑制BGC-823細(xì)胞增殖的新靶標(biāo)及作用機制。至于BGC-823細(xì)胞攝取BMSCs外泌體后對細(xì)胞侵襲和遷移的影響及BMSCs外泌體向BGC-823細(xì)胞傳遞的具體生物信息物質(zhì)，有待今后進(jìn)一步研究。

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Effects of Regulation ofDecoction for Shh Signaling Pathway on BMSCs Exosomes-induced Proliferation of Human Gastric Cancer Cells BGC-823

CUI Guoning, LIU Xiping, LI Peiqing, WANG Qingmiao, DAI Lirong, WANG Yu, ZHU Zhongbo, DONG Jungang

To observe the effects ofDecoction on the proliferation of human gastric cancer cells BGC-823 induced by exosomes of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs); To discuss its mechanism of action.BMSCs exosomes were co-cultured with BGC-823 cells in a Transwell chamber. The experiment was divided into blank group, model group, positive control group,Decoction high-, medium- and low-dosage groups. BMSCs exosomes were labeled with fluorescent dye Dil; the uptake of BMSCs exosomes by BGC-823 cells was observed with a laser confocal microscope, and the mean optical density (MOD) was calculated; Real-time label-free cell analysis technology was used to detect cell proliferation; flow cytometry was used to detect cell growth cycle; RT-qPCR was used to detect the expressions of Shh, Smo, Ptch1, Gli1 and C-myc mRNA. Results Compared with the blank group, a large number of red fluorescent markers were seen in the cells of the model group, and the MOD value significantly increased (<0.05); the cell index (CI) of the model group increased significantly between 20 and 50 hours (<0.05), the proportion of cells in G1and G2phases decreased, the proportion of cells in S phase increased (<0.05), the expressions of Shh, Smo, Ptch1, Gli1 and C-myc mRNA significantly increased (<0.05). Compared with the model group, the red fluorescent markers inDecoction groups were weakened, and the MOD value ofDecoction high- and medium-dosage groups was significantly reduced (<0.05); the CI ofDecoction groups decreased significantly between 20 and 50 hours (<0.05), the proportion of cells in G1and G2phases increased, and the proportion of cells in S phase decreased (<0.05), the expressions of Shh, Smo, Ptch1, Gli1 and C-myc mRNA were significantly reduced (<0.05).Decoction can inhibit the proliferation of BGC-823 cells induced by BMSCs exosomes. The mechanism may be related to down-regulating the expressions of Shh, Smo, Ptch1, Gli1 and C-myc mRNA and inhibiting the Shh signaling pathway.

Decoction; human gastric cancer cell; BMSCs; exosomes; Shh signaling pathway

R285.5

A

1005-5304(2021)08-0077-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202011548

國家自然科學(xué)基金（81860813、81860782）

劉喜平，E-mail：Lxp-d257@163.com

（收稿日期：2020-11-30）

（修回日期：2020-12-24；編輯：華強）