核酸轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增中室內(nèi)質(zhì)控方法的探討

季茂勝，趙 欣，張藍(lán)江，王 歡，陳 雪，董玉芳，魏彩冰

四川省成都市血液中心血液篩查實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041

目前血液核酸檢測(cè)技術(shù)(NAT)已在我國(guó)采供血機(jī)構(gòu)全面開(kāi)展和普及，檢測(cè)原理主要分為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)，使得其在檢測(cè)靈敏度和特異度方面表現(xiàn)極佳。通過(guò)利用NAT檢測(cè)人類免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)，降低了只依賴酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)獻(xiàn)血員標(biāo)本導(dǎo)致的輸血傳播性疾病的發(fā)生[1]?！堆竞怂釞z測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證指南》中提到血站核酸檢測(cè)室內(nèi)質(zhì)控的基本要求為每一批次檢測(cè)應(yīng)至少有一個(gè)弱陽(yáng)性室內(nèi)質(zhì)控品。各血站實(shí)驗(yàn)室尚未建立較統(tǒng)一的NAT質(zhì)量控制體系[2-3]，然而室內(nèi)質(zhì)控是檢測(cè)和評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系運(yùn)行情況，確定檢測(cè)結(jié)果是否可靠、穩(wěn)定的重要因素[4]。為此本中心實(shí)驗(yàn)室結(jié)合實(shí)際工作中的室內(nèi)質(zhì)控檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)繪制箱體圖法和Levey-Jennings質(zhì)控圖法回顧性分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的檢測(cè)情況，對(duì)兩種質(zhì)控分析方法在轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增中對(duì)室內(nèi)質(zhì)控的監(jiān)測(cè)情況作比較。

1 材料與方法

1.1室內(nèi)質(zhì)控品數(shù)據(jù)來(lái)源 收集2019年3月9日至7月19日本核酸實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控品(HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA)檢測(cè)的待測(cè)物信號(hào)/臨界值(S/CO值)。

1.2室內(nèi)質(zhì)控品 室內(nèi)質(zhì)控品HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA為購(gòu)于北京康徹思坦公司的標(biāo)準(zhǔn)品，水平分別為30 IU/mL、30 IU/mL、200 IU/mL，批號(hào)為20190110，有效期至2021年1月9日。

1.3儀器與試劑 HBV、HCV、HIV1型(Procleix Ultrio Plus Assay)核酸聯(lián)檢檢測(cè)試劑盒(主批號(hào)為700354，有效期至2020年5月15日)及Procleix Tigris核酸檢測(cè)系統(tǒng)均購(gòu)于蓋立復(fù)生物診斷公司，試劑使用前在試劑孵育器內(nèi)32 ℃孵育1 h。嚴(yán)格按照儀器和試劑說(shuō)明書(shū)及本實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)操作文件進(jìn)行操作。

1.4室內(nèi)質(zhì)控品檢測(cè) 從-30 ℃冰箱取出室內(nèi)質(zhì)控品室溫解凍后，上下緩慢顛倒使其充分混勻(HIV室內(nèi)質(zhì)控品為干粉狀態(tài)，使用其相應(yīng)的溶解液充分溶解后顛倒混勻)瞬間離心。在溫度15～25 ℃、濕度20%～85%環(huán)境下，室內(nèi)質(zhì)控品與常規(guī)標(biāo)本一同檢測(cè)。機(jī)器在使用的情況下，每天做一次HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 3個(gè)項(xiàng)目的室內(nèi)質(zhì)控品檢測(cè)。結(jié)果判讀：僅當(dāng)核酸檢測(cè)試劑盒自帶的校準(zhǔn)物與對(duì)照品同時(shí)有效時(shí)，室內(nèi)質(zhì)控品才能判斷為有效，記錄S/CO值。

1.5箱體圖的繪制 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0分別計(jì)算HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA室內(nèi)質(zhì)控品的中位數(shù)(M)、下四分位數(shù)(QL)、上四分位數(shù)(QU)、四分位數(shù)間距(QR)=QU-QL，繪制箱體圖判定離群值；也可以通過(guò)計(jì)算離群值上下限判定離群值，即當(dāng)S/CO值>QU+1.5QR或

2 結(jié) 果

2.1箱體圖結(jié)果 實(shí)驗(yàn)期間在一臺(tái)Procleix Tigris機(jī)器上共檢測(cè)了86組HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA室內(nèi)質(zhì)控品數(shù)據(jù)。3個(gè)項(xiàng)目的M、QL、QU、QR及離群值上、下限如表1所示。當(dāng)HBV-DNA室內(nèi)質(zhì)控品檢測(cè)的S/CO值<12.86或>15.36時(shí)判斷為離群值；HCV-RNA室內(nèi)質(zhì)控品檢測(cè)的S/CO值<8.44或>11.13時(shí)判斷為離群值；HIV-RNA室內(nèi)質(zhì)控品檢測(cè)的S/CO值<9.84或>14.51時(shí)判斷為離群值。在檢測(cè)的86組數(shù)據(jù)中HBV-DNA的第32次(S/CO值為16.03)、38次(S/CO值為16.04)為離群值；HCV-RNA室內(nèi)質(zhì)控品無(wú)離群值；HIV-RNA室內(nèi)質(zhì)控品的第32次(S/CO值為14.59)為離群值，與通過(guò)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件繪制的箱體圖所顯示的離群值結(jié)果一致，見(jiàn)圖1。

表1 室內(nèi)質(zhì)控品百分位數(shù)及離群值上、下限

圖1 室內(nèi)質(zhì)控品S/CO值箱體圖

圖2 HBV-DNA室內(nèi)質(zhì)控品Levey-Jennings質(zhì)控圖

圖4 HIV-RNA室內(nèi)質(zhì)控品Levey-Jennings質(zhì)控圖

3 討 論

箱體圖是利用數(shù)據(jù)中的5個(gè)統(tǒng)計(jì)量即最小值、QL、M、QU與最大值來(lái)描述數(shù)據(jù)的一種方法(箱體圖的最下、上線段為最小、大值；中間箱體的下、上沿為QL和QU)，它可以看出數(shù)據(jù)是否具有對(duì)稱性、分布的離散程度等信息[5]，離群值以星號(hào)或圓點(diǎn)在箱體圖的上方或下方顯示，箱體圖的繪制依靠實(shí)際數(shù)據(jù)，不需要事先假定數(shù)據(jù)服從特定的分布形式，不對(duì)數(shù)據(jù)作任何限制[6]。圖1中可以看出HIV-RNA的箱體上下高度范圍(即QR)比HBV-DNA、HCV-RNA箱體高度范圍大，表明HIV-RNA的離散程度大于HBV-DNA、HCV-RNA的離散程度，這與它們之間s、CV的差別一致[7]。

目前國(guó)內(nèi)采供血機(jī)構(gòu)核酸實(shí)驗(yàn)室普遍的做法是采用定性的方法進(jìn)行質(zhì)量控制[12]，即外部質(zhì)控品HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA檢測(cè)結(jié)果為反應(yīng)性的情況下，本批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。雖然結(jié)果中HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA室內(nèi)質(zhì)控品分別4次、4次、6次超出失控限，但S/CO值定性結(jié)果為反應(yīng)性，實(shí)際工作中筆者依然判斷當(dāng)批次檢測(cè)有效，當(dāng)室內(nèi)質(zhì)控品S/CO值超出失控限時(shí)，如果內(nèi)標(biāo)、對(duì)照有效依然可以判斷實(shí)驗(yàn)有效。這是因?yàn)樵诿恳淮螌?shí)驗(yàn)運(yùn)行過(guò)程中，Procleix Ultrio Plus Assay的內(nèi)部質(zhì)控體系通過(guò)以下3個(gè)方面達(dá)到自身實(shí)驗(yàn)監(jiān)控的目的：(1)內(nèi)標(biāo)。通過(guò)包含內(nèi)標(biāo)的目標(biāo)捕獲試劑將內(nèi)標(biāo)添加到每個(gè)檢測(cè)標(biāo)本、對(duì)照或校準(zhǔn)物管中，使試劑的內(nèi)標(biāo)在標(biāo)本處理、擴(kuò)增和檢測(cè)步驟中均可作為質(zhì)控品來(lái)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，每個(gè)測(cè)試管的有效性需要內(nèi)標(biāo)的相對(duì)光值大于或等于內(nèi)標(biāo)臨界值[13]。(2)對(duì)照。陰性對(duì)照呈無(wú)反應(yīng)性并且陽(yáng)性對(duì)照呈反應(yīng)性時(shí)本批次實(shí)驗(yàn)有效。(3)校準(zhǔn)物質(zhì)。雖然它的檢測(cè)是為了計(jì)算待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的臨界值，但它的有效或無(wú)效也能在一定程度上起到監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)的作用。內(nèi)部質(zhì)控體系可以全面覆蓋檢測(cè)的整個(gè)過(guò)程，但是僅可以作為當(dāng)批次實(shí)驗(yàn)有效性的驗(yàn)證，并不能監(jiān)測(cè)儀器整個(gè)使用周期中NAT體系(包括儀器、試劑、質(zhì)控品)的穩(wěn)定性情況[14]，而Levey-Jennings質(zhì)控圖法通過(guò)室內(nèi)質(zhì)控品的監(jiān)控可以很好地彌補(bǔ)這方面的不足。 圖2中86次HBV-DNA室內(nèi)質(zhì)控品S/CO值圍繞平均值隨機(jī)上下波動(dòng)，其中第32、38、50、62次超出失控限，分析原因發(fā)現(xiàn)第32、38、62次實(shí)驗(yàn)當(dāng)天機(jī)器出現(xiàn)“磁清洗工作臺(tái)液位感測(cè)故障”，采取的措施是實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前增加一次磁力工作站的高級(jí)磁力沖洗以減少其故障的發(fā)生，但第50次機(jī)器運(yùn)行情況正常，猜測(cè)是由機(jī)器的偶發(fā)故障所造成；圖3中HCV-RNA室內(nèi)質(zhì)控品S/CO值從第65次起出現(xiàn)在平均值一側(cè)，觀察發(fā)現(xiàn)所用蓋立復(fù)試劑并未更換批號(hào)，排除試劑原因。所用機(jī)器在六月中旬曾做過(guò)半年維護(hù)保養(yǎng)(正好為第65次的時(shí)間段)，由于測(cè)量化學(xué)發(fā)光信號(hào)的冷光儀經(jīng)過(guò)校正，導(dǎo)致室內(nèi)質(zhì)控品數(shù)值不同于校正前的數(shù)值，機(jī)器的系統(tǒng)誤差造成結(jié)果漂移，解決辦法是在維護(hù)保養(yǎng)后應(yīng)重新繪制質(zhì)控圖，以排除儀器校正對(duì)質(zhì)控結(jié)果的影響；而圖4中HIV-RNA室內(nèi)質(zhì)控品從第56次起后面的檢測(cè)值都低于平均值，分析原因可能是由于HIV-RNA作為核糖核酸易于降解(質(zhì)控品為干粉)在保存過(guò)程中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)RNA降解導(dǎo)致濃度降低，致使S/CO值低于平均值造成的，使用新訂購(gòu)的室內(nèi)質(zhì)控品并盡快使用以減少保存時(shí)間對(duì)濃度的影響。

兩種質(zhì)控方法相比較，箱體圖法僅僅可以發(fā)現(xiàn)少數(shù)離群值，而通過(guò)Levey-Jennings質(zhì)控圖中超出失控限原因的分析[15]，不僅可以評(píng)估儀器的運(yùn)行狀態(tài)，還可以監(jiān)測(cè)試劑和質(zhì)控品的質(zhì)量狀態(tài)，監(jiān)測(cè)核酸檢測(cè)體系的穩(wěn)定性，從而更好地保證核酸檢測(cè)的質(zhì)量控制。