一例林麝支氣管敗血波氏桿菌性肺炎的診斷※

●劉玉太 金學(xué)林 趙澤明 車?yán)h 吳橋興（陜西省動(dòng)物研究所 陜西 西安 710032）

林麝（Moschus berzovskii）是國家Ⅰ級重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，屬偶蹄目反芻亞目麝科麝屬。野生林麝在我國多個(gè)山區(qū)均有分布，其中陜西秦嶺地區(qū)是重要棲息地之一[1]。麝香是一種重要的中藥材和香料。為了合理保護(hù)、開發(fā)和利用，陜西省大力推廣林麝的人工馴養(yǎng)，經(jīng)過數(shù)十年的探索，在林麝馴養(yǎng)方面取得了一系列成果，陜西省的圈養(yǎng)林麝數(shù)量居全國之首[2]。

疾病是馴養(yǎng)林麝面臨的重要問題之一。林麝個(gè)體的經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，疾病給林麝養(yǎng)殖場帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，圈養(yǎng)林麝受多種疾病危害，主要的疾病類型包括呼吸道疾病、化膿性膿腫病、寄生蟲病、胃腸炎等。據(jù)調(diào)查，呼吸系統(tǒng)疾病導(dǎo)致林麝死亡的比例高達(dá)31.27%。林麝呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原包括致病性大腸桿菌、銅綠假單胞菌、巴氏桿菌等[2-6]。

支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica，以下簡稱Bb），屬于革蘭氏陰性需氧球桿菌，大小為（0.2～0.3）μm×（0.5～1.0）μm，有莢膜，散在或成對排列，可在多種培養(yǎng)基上生長。Bb可以感染多種哺乳動(dòng)物，如豬、兔、雪貂、狗、貓，也可以感染人，主要表現(xiàn)出呼吸道癥狀。Bb感染豬可導(dǎo)致萎縮性鼻炎，常給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大損失[7]。Bb可以繼發(fā)于其他傳染性疾病，導(dǎo)致動(dòng)物的呼吸道癥狀加劇，使動(dòng)物死亡率升高。Bb在豬只感染方面多呈散發(fā)或地方性流行，傳播廣泛且呈持續(xù)性感染[8]。Bb導(dǎo)致野生動(dòng)物感染的病例報(bào)道較少，北京動(dòng)物園在死亡的袋鼠、小熊貓、節(jié)尾狐猴肺組織上分離到過Bb[9]。Lacasse等[10]報(bào)道過Bb感染導(dǎo)致北極熊發(fā)生支氣管炎的病例。

本文通過對一例因Bb感染死亡的林麝進(jìn)行病理診斷和病原學(xué)分析，詳細(xì)描述了Bb感染導(dǎo)致林麝的臨床癥狀和主要臟器的病理變化，并采用16s rRNA對分離到的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，旨在為林麝呼吸系統(tǒng)疾病的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源

陜西省佛坪縣某林麝養(yǎng)殖基地1只猝死的懷孕林麝，年齡3歲。2020年5月18日13:00死亡，死后保存在有冰袋的泡沫箱中。

1.2 病理剖解和病料采集

林麝死亡當(dāng)天23:00，按照反芻動(dòng)物病理剖解規(guī)范進(jìn)行剖檢，詳細(xì)記錄主要臟器病理變化。

采集肝臟、肺臟、氣管病料，分別用普通營養(yǎng)瓊脂、血平板及麥康凱瓊脂培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)12～24 h。菌落長出后，對不同形態(tài)的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并繼續(xù)用血平板分離培養(yǎng)，采用16s rRNA引物對分離的菌落進(jìn)行鑒定，上游引物序列為gagtttgatcmtggctcag，下游引物序列為ctahagggtatctaatcct，目的片段為750 bp[11]。同時(shí)對肺臟、肝臟做組織觸片，進(jìn)行吉姆薩瑞氏染色。

采集主要組織器官，包括淺表淋巴結(jié)、扁桃體、氣管、肺臟、心臟、肝臟、脾臟、腎臟等，分別用4%中性多聚甲醛固定和凍存。固定組織進(jìn)行石蠟包埋和HE染色，并做組織病理學(xué)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床調(diào)查及癥狀

該群林麝一年前曾出現(xiàn)過呼吸道癥狀，目前部分個(gè)體已臨近生產(chǎn)。

14 d前第一例林麝出現(xiàn)精神萎靡，厭食，有明顯喘鳴音和鼻液。1 d后死亡，鼻腔內(nèi)有鮮紅色液體流出。該病例年齡3歲，雌性，臨近生產(chǎn)。

7 d前，第二例林麝出現(xiàn)類似癥狀，鼻腔有膿性白色分泌物流出。注射頭孢呋辛、林可霉素，2 d后死亡。該病例年齡4歲半，雌性，臨近生產(chǎn)。

本例為第三例，死前2 d林麝表現(xiàn)出喘鳴、鼻液等癥狀，使用拜有利治療。

三例死亡林麝圈舍位置關(guān)系，見圖1。

2.2 剖檢變化

林麝死亡時(shí)，鼻腔、口腔涌出大量紅色液體（圖2）。尸體柔軟，腹部鼓氣，被毛整齊，眼結(jié)膜蒼白。肛門糞便略稀軟，但成形。陰門處無明顯異常。

肩前、腹股溝、頜下等淺表淋巴結(jié)無明顯腫大。胸腔內(nèi)有暗紅色液體，胸膜壁層光滑。咽喉部扁桃體無明顯腫大。雙側(cè)肺臟質(zhì)地柔軟，切面有紅色液體流出，呈暗紅色，尖葉表面有淡黃色膜樣物質(zhì)附著（圖3）。氣管內(nèi)有少量泡沫樣紅色液體，黏膜充血，有淡黃色膜樣物質(zhì)附著（圖4）?？v隔淋巴結(jié)未見明顯腫大。

心包內(nèi)有淡黃色凝膠樣物質(zhì)。心臟質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，心尖外形無明顯異常，橫縱比無明顯異常。外觀呈黃紅相間條紋，右心室內(nèi)有大量血凝塊。二尖瓣、三尖瓣表面光滑。肝臟邊緣銳利，顏色呈暗黑色，切面暗紅色，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)。脾臟邊緣銳利，顏色呈暗黑色，質(zhì)地柔軟。腎臟外觀無明顯異常，被膜易剝離，切面皮質(zhì)、髓質(zhì)界限清晰。膀胱大小適中，黏膜白色，尿液清亮，未見明顯異常。腸系膜淋巴結(jié)未見腫大。子宮為雙角子宮，有兩個(gè)雌性胎兒。消化道眼觀無明顯異常。由于未攜帶開顱工具，未做神經(jīng)系統(tǒng)檢查。

2.3 組織病理學(xué)變化

2.3.1 肺臟細(xì)支氣管、肺泡腔內(nèi)充滿紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞，肺泡壁增厚，Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞水泡變性。肺泡毛細(xì)血管充血，肺泡內(nèi)可見大量網(wǎng)狀、紅染的凝固纖維蛋白。肺小葉間隔增寬（圖5-A和圖5-B）。

2.3.2 氣管黏膜結(jié)構(gòu)完整，黏膜下層毛細(xì)血管充血，間質(zhì)水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤（圖5-C）。

2.3.3 頜下淋巴結(jié)淋巴結(jié)內(nèi)毛細(xì)血管充血，被膜下水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤。皮質(zhì)淋巴濾泡反應(yīng)性增大。髓竇內(nèi)大量泡沫樣巨噬細(xì)胞（圖5-D）。

2.3.4 扁桃體扁桃體隱窩內(nèi)有少量滲出的炎性細(xì)胞及脫落細(xì)胞，淋巴濾泡排空，毛細(xì)血管充血（圖5-E）。

2.3.5 脾臟脾臟白髓區(qū)減小，淋巴細(xì)胞減少；紅髓區(qū)充血，大量含鐵血黃素沉著（圖5- F）。

2.3.6 心臟、肝臟、腎臟未見明顯異常。

2.4 組織觸片檢查

肺臟、氣管的觸片經(jīng)吉姆薩瑞氏染色后可見大量兩極著染的短桿菌，如圖6箭頭所示。

2.5 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定

普通營養(yǎng)瓊脂上僅肺臟和氣管病料有菌落生長。麥康凱瓊脂上未有菌落生長。普通營養(yǎng)瓊脂上肺臟病料形成單一的光滑、濕潤、白色、半透明的隆起，中等大小菌落，經(jīng)革蘭氏染色，可見革蘭陰性、兩極著染的球桿菌，記為A菌（圖7-A）。

普通營養(yǎng)瓊脂上氣管病料僅有一種菌落形成，為光滑、濕潤、白色、半透明的隆起，中等大小菌落，經(jīng)革蘭氏染色，可見革蘭陰性、兩極著染的球桿菌，記為B菌（圖7-B），其與肺臟病料細(xì)菌形態(tài)相近。

采用16s rRNA引物鑒定純化后的細(xì)菌，經(jīng)Genbank比對，A和B分離菌均為支氣管敗血性波氏桿菌，與編號(hào)CP050967.1的分離株同源性為99.48%。

2.6 診斷結(jié)果

綜合以上檢查結(jié)果，可以判定該病例是由敗血性波氏桿菌感染引起的出血性大葉性肺炎,并最終導(dǎo)致死亡。細(xì)菌感染主要對肺臟造成損傷，并引起脾臟、頜下淋巴結(jié)、扁桃體等免疫器官的炎性反應(yīng)和損傷。根據(jù)脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體表現(xiàn)出白髓區(qū)減小、淋巴濾泡排空等病理變化，表明動(dòng)物機(jī)體的免疫力衰竭。脾臟出現(xiàn)大量含鐵血黃素，表示細(xì)菌感染引起了大量紅細(xì)胞的崩解。

3 結(jié)論與討論

肺炎是圈養(yǎng)麝類種群面臨的重要疾病之一，主要病因?yàn)槭荏@和環(huán)境突變等刺激性因素，動(dòng)物臨床表現(xiàn)為體溫升高、呼吸淺快、膿樣鼻漏、食欲減退、喘鳴[3,12]?；挤窝椎膫€(gè)體病程發(fā)展較快，因林麝天性膽小，給藥過程中的抓捕等行為可能會(huì)加重病癥，感染肺炎后林麝死亡率較高。目前，在對圈養(yǎng)麝類動(dòng)物肺炎病原的研究中，分離到的主要病原有致病性大腸桿菌、銅綠假單胞菌、巴氏桿菌、沙門氏菌、彎曲桿菌、支原體等。其中較多病原是致病性大腸桿菌[13]，尚未有Bb感染引起林麝肺炎的病例報(bào)道。

根據(jù)臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)3頭病死林麝均是妊娠雌性個(gè)體，且3個(gè)病例的圈舍臨近，臨床癥狀和病程相似。雖然沒有前兩例病例的病料研究，但可以推測3例病例之間具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。臨床表現(xiàn)均有明顯膿性和紅色鼻漏、喘鳴等癥狀，表明可能是同一種病原引起的死亡。本病例死亡時(shí)鼻腔、口腔均有紅色液體流出。剖檢前，對鼻腔分泌物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，未見鏈狀排列的有莢膜的粗大桿菌。

氣管和肺臟表現(xiàn)出明顯的病理變化，胸腔有紅色積液，與肺臟和氣管的組織病理學(xué)變化相對應(yīng)，呈現(xiàn)典型的出血性纖維化肺炎特征。在以往報(bào)道的林麝大腸桿菌肺炎中，肺臟表現(xiàn)出多處化膿灶，并在肝臟形成轉(zhuǎn)移性膿腫灶[4,14]。而本病例的肺臟、頜下淋巴結(jié)、扁桃體和脾臟出現(xiàn)明顯的病理損傷，肺臟可見大量纖維蛋白滲出和中性粒細(xì)胞浸潤，呈現(xiàn)細(xì)菌感染的病理變化特征。同時(shí)肺泡內(nèi)有大量紅細(xì)胞滲出，表明肺泡毛細(xì)血管壁出現(xiàn)損傷。頜下淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體等免疫器官的淋巴細(xì)胞區(qū)域表現(xiàn)出不同程度的淋巴細(xì)胞排空，表明林麝的免疫機(jī)能處于不斷衰竭的過程[15]。此外，心臟、肝臟、腎臟等主要臟器并未表現(xiàn)出明顯的病理變化。

組織觸片染色和細(xì)菌分離純化后染色均可見單一的兩極著染的桿狀細(xì)菌，革蘭氏染色呈陰性。經(jīng)16s rRNA PCR鑒定和Genbank比對，與支氣管敗血性波氏桿菌的同源性為99.48%。在以往的研究中，Bb對豬和兔造成的危害比較大，可造成豬的支氣管肺炎、萎縮性鼻炎，兔主要病變也是鼻腔和肺臟，引起膿性鼻分泌物、肺臟化膿等[1,16-18]。Lacasse等[10]報(bào)道Bb可以導(dǎo)致北極熊發(fā)生氣管炎，并且具有傳染性。李偉杰等[9]采用16s rRNA方法對北京動(dòng)物園死亡的野生動(dòng)物肺臟、血液等樣品進(jìn)行分離，鑒定了數(shù)個(gè)Bb菌株，與支氣管敗血性波氏桿菌模式菌株存在很高的同源性，但未分析Bb菌株與這些動(dòng)物死因的關(guān)系，Bb菌株在野生動(dòng)物呼吸道中可能是常在細(xì)菌。當(dāng)環(huán)境改變或動(dòng)物機(jī)體免疫力降低時(shí)，Bb會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物患肺炎、氣管炎等。綜上，Bb感染是導(dǎo)致本病例發(fā)生出血性大葉性肺炎的主要原因，與以往報(bào)道的林麝肺炎病例或其他Bb所致的兔、豬的肺炎不同，該病例呈現(xiàn)發(fā)病急、病程短、致死率高的特征。預(yù)防Bb感染主要在于環(huán)境控制，在氣候多變時(shí)應(yīng)注意畜舍的保暖，減少應(yīng)激因素。對于妊娠林麝應(yīng)加強(qiáng)管理，出現(xiàn)發(fā)病個(gè)體時(shí)應(yīng)及時(shí)隔離治療。