鹿血水解物抗氧化能力研究※

●韓歡勝 郭喜明 徐 馨 柴孟龍

（1.哈爾濱博蒙生物科技有限公司 黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江普惠特產(chǎn)有限公司 黑龍江 哈爾濱 150030）

梅花鹿(Cerrus nipponTemminck) 為哺乳綱鹿科鹿屬的反芻動(dòng)物，是東北季風(fēng)區(qū)的特產(chǎn)物種[1]。鹿血是鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿（Cerrus elaphusLinaeus）膛血或茸血，性熱，味甘咸，歸肝、腎經(jīng)；具有養(yǎng)血益精、行血祛瘀、消腫療傷等功效[2]，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥，是上品動(dòng)物中藥。隨著人們對(duì)大健康的重視，對(duì)藥食同源保健品的認(rèn)可度也越來(lái)越高，因此，梅花鹿產(chǎn)業(yè)及相關(guān)副產(chǎn)品開發(fā)利用發(fā)展迅速。

鹿血中富含蛋白質(zhì)和多種氨基酸營(yíng)養(yǎng)成分[3]，研究表明動(dòng)物類藥材功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)為由氨基酸組成的活性肽。同時(shí)，氧化應(yīng)激反應(yīng)是體內(nèi)自由基產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，是導(dǎo)致衰老和許多疾病發(fā)生的重要因素之一。因此，本文比較不同蛋白酶水解鹿血后其水解物的抗氧化功效，對(duì)鹿血的開發(fā)和利用具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 鹿血樣本的采集

四只1歲齡的東北梅花鹿，雌雄各半，身形健壯，精神狀態(tài)良好，均來(lái)源于吉林省長(zhǎng)春市雙陽(yáng)鹿鄉(xiāng)鎮(zhèn)某鹿場(chǎng)。梅花鹿在采血前禁食12 h后開始麻醉，通過(guò)頸靜脈進(jìn)行采血和收集，并帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行冷凍干燥處理，粉末過(guò)篩備用 。

1.2 試驗(yàn)儀器

萬(wàn)分之一電子天平 BP211D 德國(guó) Switzerland 公司KQ-250DB 數(shù)控超聲清洗器 昆山超聲波儀器有限公司DHG-9240A 恒溫干燥箱 上海一恒科技有限公司Milli-Q Advantage A1 超純水器 美國(guó)密理博公司ELX800酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek有限公司5810R型高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司

1.3 試驗(yàn)試劑

堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶均購(gòu)于 Solarbio 公司， DPPH 自由基購(gòu)于Sigma 公司，四硼酸鈉、鄰苯二甲醛、鹽酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 試驗(yàn)方法

選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶分別對(duì)鹿血進(jìn)行酶解，篩選出最佳的蛋白酶種類。將預(yù)處理的凍干鹿血配制成溶液，分別與3種蛋白酶以底物濃度比為 1∶50進(jìn)行混合，調(diào)節(jié)三種酶反應(yīng)時(shí)最佳的溫度和pH條件，并在反應(yīng)中連續(xù)使用NaOH保持pH不變，記錄NaOH使用量（mL）和水解度（DH）。酶水解結(jié)束后，90 ℃ 水浴下滅活5 min，連續(xù)加入HCl將水解物溶液pH調(diào)整為7.0，真空冷凍干燥鹿血水解物溶液，4 ℃保存。

將凍干的鹿血水解物溶解，配置成濃度為30 mg/mL的溶液，測(cè)定不同蛋白酶水解鹿血的水解度、DPPH 自由基的清除率和總還原力。

1.4.1 水解度（DH）根據(jù)pH-Stat法[4]，水解度的計(jì)算公式為：DH=h/htot×100%。公式中h為水解后鹿血中肽鍵量（mmol/g），htot為鹿血中肽鍵的總量（mmol/g）。其中h=B×Nb×1/α×1/Mt，公式中B為鹿血水解過(guò)程中NaOH使用量(mL)，Nb為堿液的濃度（mol/L），Mt為鹿血水解物溶液中蛋白質(zhì)的量（g），1/α為校正系數(shù)。

1.4.2 DPPH自由基清除率取4mL 1×10-4mol/L DPPH和甲醇混合溶液，分別與不同酶水解產(chǎn)生的鹿血水解物溶液1mL，放入試管中搖勻，常溫避光反應(yīng) 30 min，采用分光光度計(jì)在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。DPPH自由基清除率=［1-（B1-B2）/B3］×100%。其中公式中B1為DPPH與鹿血水解物混合溶液的吸光度，B2為鹿血水解物溶液的吸光度，B3是單獨(dú)DPPH 溶液的吸光度。

1.4.3 總還原力取3.0 mL FRAP （ferric reducing/antioxidant power）試劑加熱到38℃后加入0.1 mL鹿鞭水解物和0.3 mL H2O，反應(yīng)10 min，采用分光光度計(jì)，在593 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光度的測(cè)定。同時(shí)，作陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行比較。根據(jù)繪制FeSO4·7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定鹿血水解物吸光度表示其抗氧化活性強(qiáng)弱。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excell軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定不同蛋白酶作用下鹿血水解物的水解度

如圖1所示，隨著水解反應(yīng)時(shí)間的增加，3種蛋白酶作用下鹿血水解物的水解度均增大，曲線變化明顯；其中堿性蛋白酶作用下鹿血水解物的水解度變化趨勢(shì)顯著高于中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶，為最佳水解蛋白酶種類。

2.2 測(cè)定不同蛋白酶作用下鹿血水解物DPPH自由基的清除率

如圖2所示，隨著水解反應(yīng)時(shí)間的增加，3種蛋白酶作用下鹿血水解物DPPH 自由基清除能力增強(qiáng)；其中堿性蛋白酶水解后的鹿血水解物比中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶具有更高的清除 DPPH自由基活性作用。鹿血酶水解物具有較強(qiáng)的自由基清除能力，可能與其富含色氨酸、亮氨酸和賴氨酸等氨基酸殘基具有較強(qiáng)的抗氧化能力有關(guān)。

2.3 測(cè)定不同蛋白酶作用下鹿血水解物的總還原力

如圖3所示，隨著水解反應(yīng)時(shí)間的增加，3種蛋白酶作用下鹿血的水解物總還原力增強(qiáng)；其中堿性蛋白酶作用下鹿血水解物的總還原能力均高于中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶。鹿血酶水解物具有較強(qiáng)的總還原能力，可能與其在酶水解時(shí)肽鏈發(fā)生斷裂和增加氫離子數(shù)量有關(guān)。

3 結(jié)論

本文通過(guò)采用3 種不同的蛋白酶（堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶) 在最適溫度和pH條件下水解鹿血，以水解度為指標(biāo)篩選出最佳水解蛋白酶種類為堿性蛋白酶，并研究和比較3種鹿血水解物的抗氧化活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種鹿血水解物均具有較好的抗氧化能力，隨水解反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，并且堿性蛋白酶作用下鹿血水解物的DPPH自由基清除能力和總還原能力較其他兩種蛋白酶略高。鹿血水解物抗氧化活性可能與蛋白質(zhì)水解后分解成特殊肽和氨基酸殘基成分有關(guān)，這對(duì)鹿血的進(jìn)一步開發(fā)利用和抗氧化應(yīng)激作用方面相關(guān)研究具有一定的參考價(jià)值和意義。