自動化鏡檢結(jié)合人工智能分析系統(tǒng)對陰道分泌物革蘭氏染色涂片形態(tài)學(xué)的準(zhǔn)確性評價

王 瑤，孫宏莉，趙 穎，張 麗，朱任媛，竇紅濤，原 英，劉亞麗，劉文靜，徐英春

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科 侵襲性真菌病機制研究與精準(zhǔn)診斷北京重點實驗室，北京 100730

女性陰道微生態(tài)系統(tǒng)由陰道內(nèi)微生物菌群、內(nèi)分泌系統(tǒng)、陰道局部解剖結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)共同組成，其菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多種微生物共生并發(fā)揮協(xié)同/拮抗效應(yīng)。生理情況下，陰道菌群以乳桿菌為優(yōu)勢菌群[1- 2]，在體內(nèi)外各種因素的影響下，陰道微生態(tài)失衡、致菌群異常變化，可繼發(fā)陰道炎癥或陰道感染[3]，臨床常見為細菌性陰道病(bacterial vaginosis, BV)、外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)、需氧菌性陰道炎(aerobic vaginitis, AV)和滴蟲性陰道炎(trichomonal vaginitis, TV)，由兩種及以上致病微生物導(dǎo)致的陰道炎癥屬于混合性陰道炎[4- 6]。陰道微生態(tài)評價有助于單純性陰道炎、混合性陰道炎的早期診斷，并進行針對性治療，以促進陰道微生態(tài)恢復(fù)平衡[3]。除陰道炎癥外，妊娠[7]、子宮惡性腫瘤術(shù)后放療[8]、宮頸病變或人乳頭瘤病毒感染[9- 10]、多囊卵巢綜合征[11]等人群陰道微生態(tài)評價的報道近年來也明顯增多。

陰道微生態(tài)評價方法主要包括形態(tài)學(xué)檢測和功能性檢測[3]，近年來二代測序技術(shù)也逐漸應(yīng)用于微生態(tài)評價[4]，但受限于價格高昂、報告時間較長等原因，目前臨床上仍以形態(tài)學(xué)檢測為其主要參考指標(biāo)。形態(tài)學(xué)檢測易受技術(shù)人員主觀因素的影響，且工作負荷較大，而自動化鏡檢結(jié)合人工智能分析系統(tǒng)(以下簡稱“自動化鏡檢”)有望克服上述困難。本研究旨在評估自動化鏡檢在陰道分泌物革蘭氏染色涂片形態(tài)學(xué)分析中的臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

回顧性收集2020年1—5月北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科門診患者的陰道分泌物標(biāo)本(每例患者僅收集1份標(biāo)本)，所有標(biāo)本均為臨床常規(guī)檢驗剩余樣本，并剔除樣本量過少的標(biāo)本。

本研究已通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會審批(審批號：S-T950)。

1.2 方法

1.2.1 涂片制備及革蘭氏染色

將陰拭子置于試管中，滴加少量無菌生理鹽水，沿試管壁反復(fù)用力擠壓旋轉(zhuǎn)以洗脫標(biāo)本。滴加約0.5 mL生理鹽水進行稀釋(根據(jù)液體濁度調(diào)整)，調(diào)節(jié)至適當(dāng)濃度后取1滴標(biāo)本稀釋液均勻涂片，理想濃度為25～30個細胞/高倍鏡視野(high power field, HPF)，且細胞均勻分布。待涂片干燥、固定后進行革蘭氏染色。革蘭氏染色采用WST-R全自動革蘭氏染色機(山東仕達思生物產(chǎn)業(yè)有限公司產(chǎn)品)。

1.2.2 顯微鏡檢

每張涂片均進行自動化鏡檢和人工鏡檢，均為低倍鏡檢測20個視野、油鏡檢測45個視野。自動化鏡檢采用Comet- 60au高倍鏡檢分析系統(tǒng)(山東仕達思生物產(chǎn)業(yè)有限公司產(chǎn)品)，并通過人工智能技術(shù)自動輸出判定結(jié)果。人工鏡檢由2名具有豐富經(jīng)驗的研究人員分別獨立判定，結(jié)果不一致時由第3人進行鏡檢復(fù)核。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)判定標(biāo)準(zhǔn)參考Nugent評分[12]和中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會感染性疾病協(xié)作組制定的《陰道微生態(tài)評價的臨床應(yīng)用專家共識》[3]。對菌群密集度、菌群多樣性、乳桿菌樣革蘭氏陽性桿菌、陰道加德納菌及擬桿菌樣革蘭氏陰性桿菌、革蘭氏染色不定的彎曲桿菌、酵母樣孢子、假菌絲和白細胞進行半定量分級描述，并量化評分(表1)。BV的實驗室診斷依據(jù)Nugent評分[12]，計算乳桿菌樣革蘭氏陽性桿菌、陰道加德納菌及擬桿菌樣革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏染色不定的彎曲桿菌評分之和，0～3分為正常，4～6分為中間型BV，≥7分為BV。陰道菌群密集度和菌群多樣性評分均≤1者，判定為菌群抑制。以乳桿菌樣革蘭氏陽性桿菌為優(yōu)勢菌，且菌群密集度和菌群多樣性評分均為3～4者，判定為菌群增殖過度[3]。

人工鏡檢判定結(jié)果：若2名研究人員的各項半定量評分差值的絕對值≤1，或定性結(jié)果判斷一致時，取均值為最終結(jié)果；若2名研究人員的任何一項半定量評分差值的絕對值>1，則由第3名研究人員進行獨立鏡檢，半定量評分取3次結(jié)果中最接近的2個結(jié)果的均值為最終結(jié)果；若3次評分結(jié)果兩兩差值的絕對值相等，則取3個結(jié)果的均值為最終結(jié)果。定性結(jié)果判定中，以3次結(jié)果中2次一致結(jié)果為最終結(jié)果。

1.4 觀察指標(biāo)及定義

以人工鏡檢為對照，評估自動化鏡檢對各項結(jié)果檢測的準(zhǔn)確性：(1)完全一致率：自動化鏡檢與人工鏡檢半定量評分差值的絕對值≤0.5或定性結(jié)果判斷一致的標(biāo)本數(shù)量占標(biāo)本總量的比率；(2)基本一致率：半定量評分差值的絕對值≤1.0的標(biāo)本數(shù)量占標(biāo)本總量的比率；(3)不一致率：半定量評分差值的絕對值≥1.5或定性結(jié)果判斷不一致的標(biāo)本數(shù)量占標(biāo)本總量的比率。

1.5 樣本量估算及偏倚控制

本研究按診斷性試驗樣本量的估算方法，以人工鏡檢為對照，如自動化鏡檢診斷的靈敏度為0.90±0.05，按95%置信區(qū)間水平，BV和VVC患者均為138例。本研究擬分別納入臨床初步診斷為BV和VVC患者各100例，并補充臨床初步診斷為陰道炎但未明確為BV或VVC者及非陰道炎患者各100例，以減小選擇偏倚。剔除達不到涂片細胞數(shù)要求的標(biāo)本，以減小涂片質(zhì)量對診斷準(zhǔn)確性的影響。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計算自動化鏡檢對各項目的完全一致率、基本一致率和不一致率。采用Kappa一致性檢驗評估自動化鏡檢與人工鏡檢對Nugent評分BV分類結(jié)果和真菌定性檢測結(jié)果的一致性，結(jié)果以靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度表示。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表 1 陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)半定量評分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 患者一般臨床資料

共400例患者納入本研究，其中來自婦科門診293例(73.3%，293/400)，產(chǎn)科門診89例(22.3%，89/400)，計劃生育門診18例(4.5%，18/400)；平均年齡為(32.6±9.3)歲。

2.2 人工鏡檢結(jié)果

經(jīng)人工鏡檢Nugent評分判定為BV 124例(31.0%)、中間型BV 142例(35.5%)、正常134例(33.5%)。發(fā)現(xiàn)酵母樣孢子或假菌絲陽性137例(34.3%)，其中BV合并真菌陽性29例(21.2%)、中間型BV合并真菌陽性68例(49.6%)，Nugent分類正常但真菌陽性40例(29.2%)。陰道菌群抑制者33例，其中32例(97.0%)為中間型BV，1例(3.0%)為Nugent分類正常；未見陰道菌群增殖過度患者。油鏡鏡下形態(tài)見圖1。

圖 1 陰道分泌物革蘭氏染色涂片顯微鏡下形態(tài)(油鏡視野，×1000)

2.3 自動化鏡檢對陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)評價的準(zhǔn)確性

在半定量分級項目方面，自動化鏡檢與人工鏡檢對陰道菌群多樣性檢測結(jié)果的完全一致率和基本一致率分別為52.3%和85.3%，對陰道菌群密集度、乳桿菌樣革蘭氏陽性桿菌、陰道加德納菌及擬桿菌樣革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏染色不定的彎曲桿菌檢測結(jié)果的完全一致率和基本一致率分別為81.8%～99.5%和93.3%～100%。在定性檢測項目方面，自動化鏡檢與人工鏡檢對酵母樣孢子和假菌絲檢測結(jié)果的完全一致率均高于96%，對白細胞>10個/HPF檢測結(jié)果的完全一致率為70.5%，見表2。

表 2 自動化鏡檢對陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)評價的準(zhǔn)確性(%)

2.4 自動化鏡檢Nugent評分判斷的準(zhǔn)確性

以人工鏡檢為金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)Nugent評分，自動化鏡檢對BV分類診斷的靈敏度為87.1%，特異度為96.7%，準(zhǔn)確度為90.8%，一致性檢驗Kappa值為0.861(P<0.001)，見表3。

表 3 自動化鏡檢對Nugent評分細菌性陰道病分類判定結(jié)果的交叉表

2.5 自動化鏡檢對真菌定性檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性

設(shè)定酵母樣孢子或假菌絲中任一項檢測陽性為真菌陽性。以人工鏡檢為金標(biāo)準(zhǔn)，自動化鏡檢對真菌定性檢測的靈敏度為86.9%，特異度為98.5%，準(zhǔn)確度為94.5%，一致性檢驗Kappa值為0.875(P<0.001)，見表4。

表 4 自動化鏡檢對真菌定性檢測結(jié)果的交叉表

3 討論

本研究為國內(nèi)首次對陰道分泌物革蘭氏染色涂片自動化鏡檢結(jié)合人工智能形態(tài)學(xué)分析結(jié)果與人工鏡檢結(jié)果進行比較，以評估自動化鏡檢在陰道微生態(tài)評價中的臨床應(yīng)用價值。結(jié)果顯示，自動化鏡檢與人工鏡檢對陰道菌群多樣性半定量分級檢測結(jié)果的完全一致率和基本一致率分別為52.3%和85.3%，對陰道菌群密集度、乳桿菌樣革蘭氏陽性桿菌、陰道加德納菌及擬桿菌樣革蘭氏陰性桿菌、革蘭氏染色不定的彎曲桿菌半定量分級檢測結(jié)果的完全一致率和基本一致率為81.8%～99.5%和93.3%～100%，對酵母樣孢子和假菌絲定性檢測結(jié)果的一致率均高于96%，對白細胞>10個/HPF檢測結(jié)果的完全一致率為70.5%。對Nugent評分BV分類、真菌定性檢測的準(zhǔn)確度分別為90.8%和94.5%，一致性檢驗Kappa值分別為0.861和0.875(P<0.001)，提示Comet- 60au高倍鏡檢分析系統(tǒng)對陰道分泌物革蘭氏染色涂片中細菌與真菌形態(tài)學(xué)、BV分類及真菌定性檢測結(jié)果與人工鏡檢結(jié)果的一致性均較高，對白細胞數(shù)目判定的一致性略低。

顯微鏡檢查作為一項形態(tài)學(xué)檢驗項目，對檢驗人員的形態(tài)學(xué)經(jīng)驗要求較高，由于檢查結(jié)果受檢驗人員主觀因素影響較大，且工作負荷大，一直以來是臨床檢驗技術(shù)的難點。近年來，人工智能與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域快速融合，在影像、病理、檢驗等學(xué)科的應(yīng)用進行了探索。由于微生物形態(tài)學(xué)的復(fù)雜性，目前自動化鏡檢在臨床微生物檢驗中僅初步應(yīng)用于復(fù)雜程度相對較低的濕片鏡檢和抗酸染色鏡檢，其在復(fù)雜程度較高的革蘭氏染色鏡檢中的應(yīng)用尚處于探索性研究階段。在顯微鏡圖像自動化采集方面，雖然已有廠家開發(fā)了相關(guān)技術(shù)平臺，但在革蘭氏染色微生物形態(tài)學(xué)人工智能識別方面，鮮有可直接應(yīng)用于臨床的成熟技術(shù)。

Comet- 60au高倍鏡檢分析系統(tǒng)是基于深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)搭建的目標(biāo)檢測模型結(jié)合機器視覺方法，旨在實現(xiàn)對陰道微生態(tài)顯微圖像中多種類型目標(biāo)物的檢測和分析。檢測過程中將涂片插入裝載模塊后，顯微鏡可自動加載涂片并自動對焦、切換物鏡、滴加鏡油，自動采集圖像、識別并輸出結(jié)果以及計算Nugent評分，閱片結(jié)束后自動歸位涂片、清洗物鏡，檢測速度不低于50張涂片/h。人工智能分析系統(tǒng)可識別的目標(biāo)物包括桿菌、酵母樣孢子、假菌絲、上皮細胞、白細胞等，每種目標(biāo)物根據(jù)數(shù)量分為“多、少、無”3種情況，桿菌從形態(tài)上分為“長且卷曲”和“短且直立”兩種類型，酵母樣孢子從形態(tài)上分為“卵圓形孢子”和“芽生孢子”，假菌絲從形態(tài)和方向上標(biāo)化為“水平”和“垂直”，上皮細胞和白細胞從染色程度上分為“深染”和“正?！眱煞N情況。以上標(biāo)化特征經(jīng)排列組合可組成23 318種不同的顯微圖像場景，可見陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)評價具有高度復(fù)雜性。通過采集上述所有類型的樣本圖像，經(jīng)微生物學(xué)專家對所需識別的病原體和細胞人工標(biāo)注后建立訓(xùn)練集。依托百萬級訓(xùn)練集，建立基于深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)搭建的目標(biāo)檢測模型，針對每一種圖像識別類型設(shè)計優(yōu)化的人工智能算法，最終實現(xiàn)陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)分析。

新的檢驗程序常規(guī)應(yīng)用于臨床前，實驗室應(yīng)對其性能進行驗證。根據(jù)《臨床微生物檢驗程序驗證指南》，微生物顯微鏡檢查評價方法與對照方法檢測結(jié)果的符合率≥80%，即通過驗證[13]。本研究結(jié)果顯示，自動化鏡檢與人工鏡檢對陰道菌群密集度、乳桿菌樣革蘭氏陽性桿菌、陰道加德納菌及擬桿菌樣革蘭氏陰性桿菌檢測結(jié)果的完全一致率和基本一致率分別為81.8%～83.0%和93.3%～97.8%；陰道菌群多樣性作為復(fù)雜程度更高的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，自動化鏡檢與人工鏡檢對其檢測結(jié)果的完全一致率雖偏低，但基本一致率可達85.3%，提示Comet- 60au高倍鏡檢分析系統(tǒng)對陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)的評定性能可滿足臨床檢測要求。在對Nugent評分BV分類的判斷中，以人工鏡檢為對照，自動化鏡檢的準(zhǔn)確度為90.8%，Kappa值為0.861(P<0.001)，提示兩種方法對BV分類判定的一致性亦較高。酵母樣孢子和假菌絲陽性是診斷VVC的鏡檢指標(biāo)，本研究自動化鏡檢與人工鏡檢對酵母樣孢子和假菌絲定性檢測結(jié)果的完全一致率分別為96.8%和97.3%，自動化鏡檢的準(zhǔn)確度為94.5%，Kappa值為0.875(P<0.001)，說明在對真菌定性檢測中，Comet- 60au高倍鏡檢分析系統(tǒng)與人工鏡檢亦具有較高的一致性。白細胞>10個/HPF是Donders評分[14]中進行AV診斷的評價指標(biāo)之一。本研究自動化鏡檢與人工鏡檢對白細胞>10個/HPF判定結(jié)果的完全一致率略低(70.5%)，可能原因：Donders評分所采用的檢測方法為濕片鏡檢，本研究自動化鏡檢所采用的是革蘭氏染色油鏡鏡檢，然后將油鏡視野下的判定結(jié)果換算為高倍鏡視野下的結(jié)果，而人工鏡檢則直接采用高倍鏡鏡檢。油鏡鏡檢(×1000)與高倍鏡鏡檢(×400)的鏡下面積存在差異，加之標(biāo)本中白細胞并非完全均勻分布于整個涂片，鏡檢視野的選擇可能會影響兩種方法對白細胞鏡下數(shù)目判定結(jié)果的一致率。算法的進一步優(yōu)化，將有助于提高這一指標(biāo)的準(zhǔn)確性。此外，Comet- 60au系統(tǒng)已進行了陰道分泌物濕片人工智能自動化鏡檢功能的研發(fā)和驗證，以滿足Donders評分和滴蟲鏡檢的方法學(xué)要求。

本研究局限性：(1)僅收集2例革蘭氏染色不定的彎曲桿菌陽性標(biāo)本，自動化鏡檢對該項目的檢測性能需擴大樣本量進一步驗證。(2)采用Nugent評分作為BV的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其獲得了2015年美國疾病控制與預(yù)防中心制定的《2015年性傳播疾病治療指南》[15]、2020年美國婦產(chǎn)科學(xué)會制定的第215號實踐指南《非妊娠患者陰道炎》[16]和中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會感染性疾病協(xié)作組制定的《細菌性陰道病診治指南(2021修訂版)》[17]共同推薦。但自動化鏡檢未對其他BV形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)(如Hay-Ison標(biāo)準(zhǔn)[18])的檢測準(zhǔn)確性進行驗證。(3)僅對陰道分泌物涂片進行革蘭氏染色，對細菌、真菌和白細胞等進行形態(tài)學(xué)分析，但對于革蘭氏染色難以觀察到的滴蟲、支原體、衣原體、病毒等陰道炎病原體，以及使用其他鏡檢方法進行判定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，未能進行自動化鏡檢準(zhǔn)確性驗證。對于AV的診斷，《2018歐洲國際性病控制聯(lián)盟/世界衛(wèi)生組織關(guān)于陰道分泌物(陰道炎癥)管理指南》[19]和中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會感染性疾病協(xié)作組制定的《需氧菌性陰道炎診治專家共識(2021版)》[20]均采用Donders評分[14]，其需對陰道分泌物進行濕片鏡檢，因而本文未對該系統(tǒng)診斷AV的準(zhǔn)確性進行評定；對于VVC的診斷，美國指南[15- 16]、歐洲指南[19]和我國中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會感染性疾病協(xié)作組2012年《外陰陰道假絲酵母菌病(VVC)診治規(guī)范修訂稿》[21]均推薦進行真菌鏡檢，其中陰道分泌物濕片鏡檢的靈敏度為40%～60%，革蘭氏染色鏡檢的靈敏度約為65%[19]，本研究僅采用了革蘭氏染色，未對濕片鏡檢法進行驗證。

綜上，在對陰道分泌物革蘭氏染色涂片陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)評價中，自動化鏡檢與人工鏡檢具有較好的一致性，可通過Nugent評分、酵母樣孢子和假菌絲鏡檢結(jié)果提供BV和VVC的診斷依據(jù)，顯著提高實驗室鏡檢效率、降低人工鏡檢勞動負荷，具有較好的臨床應(yīng)用價值。

作者貢獻：王瑤負責(zé)研究方案設(shè)計、實驗操作、數(shù)據(jù)采集與分析及論文撰寫；孫宏莉、趙穎、張麗、朱任媛、竇紅濤、原英、劉亞麗和劉文靜負責(zé)實驗操作及數(shù)據(jù)采集；徐英春負責(zé)數(shù)據(jù)審核及內(nèi)容審校。

利益沖突：本研究獲得山東仕達思生物產(chǎn)業(yè)有限公司的技術(shù)支持，所有研究人員均不存在利益沖突