昆蟲病原線蟲JLSY 003的鑒定及其生物學(xué)特性測(cè)定

田成麗，李茂海，劉金文，張金花，朱 峰，李建平

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，公主嶺 136100）

昆蟲病原線蟲（Entomopathogenic nematodes，EPNs）是在5 d之內(nèi)對(duì)寄主昆蟲的致死率達(dá)到50%以上的線蟲[1]，主要分布在5個(gè)總科：尖尾總科Oxyuroidea、滑刃總科Aphelenchoidea、墊刃總科Tylenchoidea、小桿總科Rhabditoidea及索線蟲總科 Mermithoidea。部分種類EPNs已被開發(fā)并廣泛用于防治多種害蟲。Oscheius屬于小桿總科，Andrássy于 1976年首次建立了該屬[2]，Oscheius屬由取食細(xì)菌的自由生活線蟲（Free-living nematodes，F(xiàn)LNs）和EPNs組成，共46個(gè)種[3-6]。

Oscheius屬中的EPNs具有較高的致病力[7]，2015—2019年，全世界共分離鑒定出5種Oscheius屬的EPNs，分別是O.indicusn.sp.[5]、O.basothoviin.sp.[6]、O.safricana[8]、O.microvilli[9]和O.onirici[10]。其中O.basothoviin.sp 在72 h內(nèi)對(duì)黃粉蟲幼蟲Tenebriomolitor的致死率高達(dá)100%[6]；O.microvilli在濃度為320 IJs/mL，48 h時(shí)對(duì)大蠟螟的致死率為93.1%[9]；O.onirici對(duì)蔓越莓上的紅頭跳甲Systenafrontalis致死率為67%[11]，對(duì)Sparganothissulfureana幼蟲的致死率為75%，對(duì)藍(lán)莓上的日本斑翅果蠅Drosophilasuzukii蛹的羽化率降低了78.2%[12]。

George和Poinar[13]首次從美國(guó)的馬陸Oxidisgracili中分離出O.myriophila，并命名，隨后Erba?等[14]和Al-Zaidawi等[15]從土耳其歐洲螻蛄Gryllotalpagryllotalpa和伊拉克的土樣中分離出O.myriophila，董臘梅[16]和張喆等[17]在中國(guó)土壤樣品中分離獲得該線蟲。上述報(bào)道僅限于種類鑒定或與植物病原線蟲的關(guān)系研究，均未對(duì)該線蟲與昆蟲的關(guān)系進(jìn)行任何生物學(xué)測(cè)定。

來(lái)源于不同地理環(huán)境中的同種EPNs在抗逆性、侵染力及繁殖力等生物學(xué)特性方面常有差異，對(duì)EPNs的生物學(xué)特性的測(cè)定和評(píng)估等是決定一種EPNs是否有開發(fā)利用價(jià)值的依據(jù)。本研究對(duì)從吉林省土樣中分離出的JLSY 003線蟲進(jìn)行了分子鑒定，測(cè)定了其致病力、耐高溫性及繁殖力，目的是明確該線蟲是否具有開發(fā)利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

昆蟲病原線蟲：O.myriophilaJLSY 003 分離自吉林省松原市（124°44′21″ E，44°55′ 36″ N）多年生人工林下0～20 cm表層土，本實(shí)驗(yàn)室保存。

大蠟螟GalleriamellonellaL.來(lái)自吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

1.2 JLSY 003線蟲的分子鑒定

參照田成麗等[18]和王江嶺等[19]的單條線蟲 DNA 提取方法。擴(kuò)增線蟲28S基因的保守區(qū)D2-D3，D2A：5′-AGCGGAGGAAAAGAAACTAA-3′[20]，D3B：5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′[21]。擴(kuò)增線蟲的 ITS rDNA：TW81：5′-GCGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′；AB28：5′-GCGGATCCATATGCTTAAGT TCAGCGGGT-3′[22]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

25 μL PCR 反應(yīng)體系：12.5 μL Mix Taq DNA 聚合酶，ddH2O 8.5 μL，正反引物各 1 μL，DNA 模板 2 μL。反應(yīng)程序參照Ye等[23]。產(chǎn)物分別由生工生物工程（上海）股份有限公司和北京六合華大基因測(cè)序部純化、測(cè)序。所得序列登入GenBank的blastan（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)[24]，再利用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析待鑒定線蟲與相關(guān)線蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1.3 JLSY 003線蟲的生物學(xué)特性

1.3.1 JLSY 003線蟲對(duì)大蠟螟侵染力測(cè)定（LC50、LT50） 在鋪有2層濾紙（直徑為60 mm）的培養(yǎng)皿中放入10頭大蠟螟，分別均勻滴入含20、40、80、160和320 IJs/larva的線蟲懸浮液各1 mL，置于25 ℃、RH為75%的恒溫避光培養(yǎng)箱中，3次重復(fù)，清水作為對(duì)照。每12 h記錄大蠟螟的死亡數(shù)量，計(jì)算大蠟螟死亡率、校正死亡率、24 h和48 h時(shí)LC50和80、160 IJs/larva濃度下的LT50。大蠟螟死亡率（%）＝死亡大蠟螟蟲口數(shù)量/供試大蠟螟蟲口數(shù)量×100%；大蠟螟校正死亡率（%）＝（處理大蠟螟死亡率—對(duì)照大蠟螟死亡率）/（1—對(duì)照大蠟螟死亡率）×100%。

1.3.2 JLSY 003高溫耐受性測(cè)定 參照Glazer[18,25]測(cè)定JLSY 003線蟲在40、38和36 ℃下的高溫耐受性。取新收集的濃度為1000 IJs/mL且存活力100%的線蟲懸浮液5 mL，放入1.8 cm×7.5 cm的平底試管中，用封口膜封口后置于水浴鍋中。每個(gè)處理3次重復(fù)，每20 min從試管中吸取100 μL線蟲懸浮液放入加有1 mL無(wú)菌水的1.5 mL EP管中，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置24 h后，記錄線蟲的死亡數(shù)量。

1.3.3 JLSY 003產(chǎn)量測(cè)定 對(duì)每個(gè)重復(fù)侵染致死的（侵染劑量160 IJs/larva）大蠟螟幼蟲進(jìn)行稱重，每10頭大蠟螟為1組，3次重復(fù)。將死亡大蠟螟放入線蟲收集盤[26]，待線蟲收集完畢，記錄線蟲總數(shù)量，計(jì)算出每條大蠟螟幼蟲產(chǎn)出侵染期線蟲的數(shù)量（IJs/larva）和每克大蠟螟幼蟲產(chǎn)出侵染期線蟲的數(shù)量（IJs/g）[27]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)涉及的數(shù)據(jù)分析均使用Excel 2010和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件完成。利用SPSS 19.0 軟件中LSD和Duncan’s多重比較法進(jìn)行差異顯著性測(cè)定，概率水平為P＜0.05?；貧w方程及LC50、LT50用Probit模型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線蟲JLSY 003分子生物學(xué)鑒定

PCR擴(kuò)增得到的28S rDNA和ITS基因片段大小分別為877和863 bp。分別與GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建相應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹并分析，待鑒定線蟲JLSY 003的28S序列與O.myriophila種群（AY602176.1）99.88%同源（圖1）；ITS序列和O.myriophila種群（MG742125.1）99.06%同源（圖2）。由28S rDNA和ITS基因比對(duì)結(jié)果可知，JLSY 003線蟲為O.myriophila品系。

圖1 基于D2-D3基因序列構(gòu)建的JLSY 003系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of JLSY 003 based on D2-D3 sequences data

圖2 基于ITS基因序列構(gòu)建的JLSY 003系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of JLSY 003 based on ITS sequences data

2.2 線蟲JLSY 003生物學(xué)測(cè)定

2.2.1 線蟲JLSY 003對(duì)大蠟螟末齡幼蟲的侵染力測(cè)定 結(jié)果表明，相同時(shí)間下經(jīng)20～320 IJs/larva的5個(gè)不同濃度處理，大蠟螟的死亡率隨著線蟲濃度的增加而升高。相同濃度下，死亡率隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。侵染12、24 h時(shí)，80 IJs/larva濃度下的死亡率與160 IJs/larva無(wú)顯著差異（P＞0.05），但與其他侵染濃度差異顯著（P＜0.05）；侵染36 h及以上時(shí)，與20、40 IJs/larva差異顯著（P＜0.05），與其他兩組差異不顯著（P＞0.05）。該濃度下侵染48 h的死亡率達(dá)到90%，72 h時(shí)全部死亡（圖3）。上述結(jié)果表明，線蟲JLSY 003的最適侵染濃度為80 IJs/larva。

24 h時(shí)，線蟲JLSY 003對(duì)大蠟螟的致死中濃度LC50為46.067 IJs/larva；48 h時(shí)LC50為25.297 IJs/larva（表1）。線蟲JLSY 003濃度為80 IJs/larva時(shí)，線蟲JLSY 003致死中時(shí)間LT50為15.409 h，160 IJs/larva濃度時(shí)，LT50為10.334 h（表2）。

表1 24和48 h時(shí)JLSY 003對(duì)大蠟螟末齡幼蟲的致病力測(cè)定Table 1 The pathogenicity of JLSY 003 to last instar G.mellonella larvae at the 24 h and 48 h

表2 80和160 IJs/larva條件下JLSY 003對(duì)大蠟螟末齡幼蟲的致病力測(cè)定Table 2 The pathogenicity of JLSY 003 of the 80, 160 IJs/larva to last instar G.mellonella larvae

2.2.2 線蟲JLSY 003對(duì)高溫的耐受性測(cè)定 結(jié)果表明，相同時(shí)間下，隨著溫度的升高，線蟲的死亡率增高。線蟲JLSY 003在2 h時(shí)難以耐受40 ℃的高溫，死亡率高達(dá)96.31%，而38 ℃、36 ℃的死亡率分別為8.77%和5.29%。相同溫度下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，線蟲死亡率增高。當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間時(shí)，死亡率急速增高。在38 ℃條件下，4 h后線蟲死亡率快速增加，8 h時(shí)死亡率為84.36%。36 ℃條件下，8 h時(shí)死亡率為19.27%，64 h內(nèi)線蟲全部死亡。上述結(jié)果表明，線蟲JLSY 003在36 ℃條件下，至少可耐8 h的高溫，死亡率為19.27%（圖4）。

圖4 JLSY 003在不同溫度下的死亡率Fig.4 Mortality rate of JLSY 003 at different temperature

2.2.3 線蟲JLSY 003產(chǎn)量測(cè)定 在25 ℃下，被線蟲JLSY 003（濃度為160 IJs/larva）侵染致死的大蠟螟平均體質(zhì)量為0.399 g，每條大蠟螟產(chǎn)出的線蟲數(shù)量為1.873×105IJs/larva，每克大蠟螟所產(chǎn)線蟲數(shù)量為4.695×105IJs/g。

3 討論

作為一種重要生物防治技術(shù)的EPNs早已被廣泛用于防治多種害蟲。不同種類EPNs或同一種來(lái)自不同地理環(huán)境的EPNs之間在抗逆性、繁殖力、侵染力及對(duì)不同寄主昆蟲的致死力等方面差異很大[28]，篩選出適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境條件、綜合表現(xiàn)好的線蟲種類（品系）對(duì)開發(fā)利用EPNs尤為重要。

至今為止，有限的幾篇有關(guān)O.myriophila的報(bào)道僅為該線蟲的基因?qū)W、種類鑒定及對(duì)植物病原線蟲種群結(jié)構(gòu)的影響[16]，尚缺少有關(guān)該線蟲的生物學(xué)測(cè)定報(bào)道。本研究表明，在侵染力和侵染時(shí)間方面，JLSY 003在80 IJs/larva濃度下具有較高的侵染力，48 h時(shí)死亡率為90%，LT50為15.409 h，LC50為25.297 IJs/larva，顯著低于相同時(shí)間下S.litorale的LC50（153.419 IJs/larva）[29]。24 h時(shí)的LC50為46.067 IJs/larva，低于相同時(shí)間下O.basothoviin.sp.的 LC50（100 IJs/larva）[6]。

EPNs的侵染力在一定范圍內(nèi)隨著溫度的升高而增強(qiáng)，超過一定的溫度范圍后，侵染力和繁殖力快速下降，死亡率增加。明確EPNs的耐溫性，有助于正確選擇適應(yīng)當(dāng)?shù)貧夂驐l件的EPN品系。繁殖力和耐熱性方面，JLSY 003在36 ℃條件下至少能耐受8 h，水浴4 h時(shí)，線蟲死亡率僅為8.79%，相同處理下的S.feltiae(TUR-S3)死亡率為100%[30]。在38 ℃、2 h條件下，JLSY 003的死亡率為8.77%，相同處理下H.bacteriophoraXJZL 1409的死亡率高達(dá)99.67%[27]。表明JLSY 003在侵染力、繁殖力、致死力、侵染時(shí)間及耐高溫方面綜合表現(xiàn)較好。

本研究中僅用大蠟螟對(duì)JLSY 003的侵染力、侵染時(shí)間、繁殖力及耐溫性方面進(jìn)行了基礎(chǔ)生物學(xué)測(cè)定，是否具有開發(fā)利用價(jià)值，尚需進(jìn)一步對(duì)靶標(biāo)害蟲（如天牛、蠐螬、金針蟲及地老虎等）進(jìn)行系統(tǒng)的室內(nèi)外生物測(cè)定和評(píng)估。