天然?；撬釋毙砸钟裟Ｐ托∈蟮母深A(yù)作用

張曉富，周 茜，袁 靜，韓 雪，王 頡，趙 文

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心 河北保定 071001）

抑郁癥是以抑郁為主要癥狀的一種常見病，隨著抑郁癥發(fā)病率的急劇增加，關(guān)于抑郁癥的研究成為近年來的熱點(diǎn)。抑郁癥的病因和發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前市場上用來治療抑郁癥的藥物大多以增加神經(jīng)遞質(zhì)的含量發(fā)揮其治療效果，然而，此類藥物并不能用于治療所有抑郁癥，且具有藥效延期的特性，抑郁癥狀嚴(yán)重的患者服用存在一定風(fēng)險。有些抗抑郁藥物還存在一定副作用，會對患者心血管系統(tǒng)造成一定程度的損傷[1-2]。開發(fā)安全有效的預(yù)防、治療抑郁癥的藥物和營養(yǎng)補(bǔ)充劑一直是研究的熱點(diǎn)。

?；撬崾且环N廣泛分布于動物及人體器官中的功能性物質(zhì)，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富。天然?；撬釓V泛存在于海魚、貝類等海生動物體內(nèi)，并主要以游離狀態(tài)存在[3-5]。海洋生物是較好的天然?；撬崽崛≡希哂袕V闊的發(fā)展前景。近年來，有關(guān)?；撬峁πУ难芯恐饕▽π难?、神經(jīng)和消化系統(tǒng)的保護(hù)作用，比如緩解疲勞[6]，改善肝損傷[7]，改善乙醇引起的焦慮[8]等。然而，關(guān)于其干預(yù)抑郁形成的研究證據(jù)尚不充分。本文采用急性應(yīng)激模型中的行為絕望及利血平誘導(dǎo)的急性抑郁模型，研究天然?；撬釋辜毙砸钟粜纬傻男Ч皺C(jī)制，為天然?；撬嶙鳛榭挂钟羯攀逞a(bǔ)充劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

ICR 雄性小鼠，SPF 級，7～8 周齡，北京華阜康實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2009-0004，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)材料與試劑

天然?；撬幔迪犔崛。兌取?9.9%），上?？刀∩锟萍加邢薰?；利血平，天津金耀藥業(yè)有限公司；氟西汀，法國Patheon France。

所有ELISA 試劑盒均購自武漢博士德生物有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

小型動物電子體溫計(jì)，廣州新代生物科技有限公司；無蓋紙箱（72 cm×72 cm×30 cm）；小鼠游泳水槽（15 cm×15 cm×20 cm）；Scientz-48 高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；1500-823 型全波長掃描酶標(biāo)儀，美國Thermo Scientific 公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 行為絕望實(shí)驗(yàn) 小鼠隨機(jī)分成5 組，每組10 只。3 個天然?；撬釀┝拷M（0.5，1，2 g/kg bw），同時設(shè)溶劑對照組（蒸餾水）和陽性對照組（氟西汀10 mg/kg bw）。

灌胃給藥第8，9，10 天分別進(jìn)行懸尾、強(qiáng)迫游泳、礦場行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 利血平誘導(dǎo)的抑郁實(shí)驗(yàn) 將小鼠按1.4.1節(jié)所述分組，同時增設(shè)模型組（灌胃蒸餾水），連續(xù)14 d。末次灌胃0.5 h 后溶劑對照組腹腔注射生理鹽水，其余組腹腔注射利血平（2.5 mg/kg bw），注射后1 h 觀察各組動物眼瞼下垂情況，3 h 后測肛溫、出圈率。

記錄動物體重，收集血清、血漿，處死動物，取腦組織稱重。酶標(biāo)儀測定血清中的促腎上腺皮質(zhì)激素（ATCH）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、血漿皮質(zhì)醇（COR）。利用勻漿儀制備10%的腦勻漿，酶標(biāo)儀檢測腦勻漿的五羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）、單胺氧化酶（MAO）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）水平。

1.4.3 行為學(xué)指標(biāo)

1.4.3.1 懸尾、強(qiáng)迫游泳、礦場實(shí)驗(yàn) 灌胃給藥第8，9，10 天，結(jié)束灌胃1 h 后，進(jìn)行懸尾、強(qiáng)迫游泳、礦場行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，方法參照本團(tuán)隊(duì)前期建立的行為學(xué)方法[9]。

1.4.3.2 眼瞼下垂 眼瞼下垂程度判斷標(biāo)準(zhǔn)：完全睜開0 度；1/4 下垂1 度；1/2 下垂2 度；3/4 下垂3 度；完全閉合4 度[9-10]。

1.4.3.3 測肛溫 在小鼠肛門1 cm 處測量肛溫。

1.4.3.4 測量出圈率 在直徑7.5 cm 的白紙圓圈內(nèi)觀察15 s 內(nèi)每只小鼠是否出圈，記錄出圈只數(shù)，計(jì)算各組動物的出圈率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS Statistics 25 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，行為學(xué)及血清指標(biāo)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示。

2 結(jié)果和分析

2.1 天然?；撬釋π袨榻^望小鼠干預(yù)作用

如圖1a 結(jié)果所示，中劑量（1 g/kg bw）和高劑量（2 g/kg bw）天然?；撬峤M的懸尾不動時間均極顯著低于正常小鼠（P＜0.01）；且低劑量組極顯著高于氟西汀對照組，中劑量組與其無顯著性差異，高劑量組顯著降低（P＜0.05）。表明低劑量（0.5 g/kg bw）天然?；撬峤M與氟西汀縮短小鼠懸尾不動時間的效果具有一定差距，中劑量組則與陽性對照組相當(dāng)，高劑量組效果優(yōu)于陽性對照組。

如圖1b 結(jié)果所示，與溶劑對照組比較，天然?；撬嶂袆┝拷M的游泳不動時間顯著降低（P＜0.05），高劑量組極顯著降低（P＜0.01）。與氟西汀對照組相比，各劑量組均無顯著性差異，表明在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，天然?；撬峥煽s短游泳不動時間，且具有劑量依賴性。

如圖1c 結(jié)果所示，與溶劑對照組相比，中劑量（1 g/kg bw）天然牛磺酸組的水平、垂直運(yùn)動次數(shù)顯著升高（P＜0.05），高劑量組的水平、垂直運(yùn)動次數(shù)極顯著升高（P＜0.01），表明在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，天然?；撬峥缮咚?、垂直運(yùn)動次數(shù)，且具有劑量依賴性。與氟西汀對照組相比，高劑量的天然牛磺酸可顯著提高垂直運(yùn)動次數(shù)（P＜0.05），表明中、高劑量組?；撬嵩谔岣咝∈笞灾鬟\(yùn)動水平上與陽性對照組的作用效果接近。

圖1 天然?；撬釋π袨榻^望小鼠干預(yù)作用的影響（±s，n=10）Fig.1 Interventional effect of natural taurine on behavioral despair in mice（±s，n=10）

2.2 天然?；撬釋秸T導(dǎo)抑郁模型小鼠體重、腦重的影響

如圖2結(jié)果所示，溶劑對照組、模型組、氟西汀對照組小鼠的體重和腦重相比，均無顯著性差異。牛磺酸干預(yù)后，小鼠的體重和腦重均未出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）。表明牛磺酸的干預(yù)對抑郁小鼠體重和腦重均無明顯影響。

圖2 天然牛磺酸對小鼠體重和腦重的影響（±s，n=10）Fig.2 Effects of natural taurine on body weight and brain weight in mice（±s，n=10）

2.3 天然?；撬釋秸T導(dǎo)抑郁模型小鼠眼瞼下垂度、體溫、出圈率的影響

如圖3結(jié)果所示，溶劑對照組和模型組動物的眼瞼下垂度、體溫均存在極顯著差異（P＜0.01），表明抑郁模型小鼠在眼瞼下垂度、體溫方面抑郁癥狀明顯；陽性對照組眼瞼下垂度也極顯著低于模型組（P＜0.01），同時體溫也極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，?；撬嶂小⒏邉┝拷M眼瞼下垂度分別顯著性降低（P＜0.05）和極顯著性降低（P＜0.01），各劑量組小鼠的體溫均未表現(xiàn)出差異性。結(jié)果表明天然?；撬嶂小⒏邉┝拷M可以緩解抑郁小鼠眼瞼下垂情況。各組小鼠出圈率均為100%，表明利血平誘導(dǎo)的小鼠模型在出圈率試驗(yàn)中未表現(xiàn)出明顯的抑郁癥狀。

圖3 牛磺酸對小鼠眼瞼下垂度、體溫、出圈率的影響（±s，n=10）Fig.3 Effects of natural taurine on blepharoptosis，body temperature and exit rate in mice（±s，n=10）

2.4 天然?；撬釋秸T導(dǎo)抑郁模型小鼠5-HT、DA、NE 的影響

如圖4結(jié)果所示，與正常小鼠相比，模型組小鼠的5-HT、DA、NE 均極顯著性降低（P＜0.01）。與抑郁小鼠比較，中劑量（1 g/kg bw）天然?；撬峤M的NE、DA 均顯著升高（P＜0.05），高劑量（2 g/kg bw）5-HT、NE 分別顯著性升高（P＜0.05）和極顯著性升高（P＜0.01）。結(jié)果表明天然?；撬釋σ钟艟哂懈深A(yù)效果，且其干預(yù)作用呈劑量依賴性。與氟西汀對照組比較可知，高劑量的天然?；撬崤c氟西汀的干預(yù)效果相當(dāng)。

圖4 天然牛磺酸對小鼠腦組織5-HT（a）、DA（b）和NE（c）含量的影響（±s，n=10）Fig.4 Effects of natural taurine on 5-HT（a），DA（b） and NE（c） contents in brain of mice（±s，n=10）

2.5 天然牛磺酸對利血平誘導(dǎo)抑郁模型小鼠MAO 和BDNF 的影響

如圖5結(jié)果所示，與溶劑對照組相比，模型組小鼠的MAO 極顯著升高（P＜0.01），BDNF 極顯著降低（P＜0.01）。牛磺酸干預(yù)后，與模型組相比，牛磺酸低劑量組的MAO 顯著降低（P＜0.05），中、高劑量組的MAO 極顯著降低（P＜0.01），高劑量組BDNF 極顯著升高。結(jié)果表明?；撬峥梢酝ㄟ^改善MAO 酶活和BDNF 水平來改善抑郁，且高劑量組降低MAO、升高BDNF 的作用與陽性藥物相當(dāng)。

圖5 天然?；撬釋π∈驧AO 活力（a）、BDNF（b）含量的影響（±s，n=10）Fig.5 Effects of natural taurine on MAO（a） and BDNF（b） contents in mice（±s，n=10）

2.6 天然牛磺酸對利血平誘導(dǎo)抑郁模型小鼠CRF、ACTH 和COR 的影響

如圖6結(jié)果所示，模型組小鼠CRF、ACTH、COR 均極顯著高于正常小鼠（P＜0.01），表明造模成功。與模型組相比，低劑量的天然?；撬峥梢燥@著降低ACTH、COR 水平（P＜0.05），中劑量（1 g/kg bw）和高劑量（2 g/kg bw）組的CRF、ACTH、COR 均極顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明天然牛磺酸有一定的干預(yù)抑郁作用。與氟西汀對照組比較可知，中、高劑量組?；撬峤档虲RF、ACTH、COR作用與陽性對照組相當(dāng)。

圖6 天然?；撬釋π∈笱錍RF（a）、ACTH（b）和血漿COR（c）含量的影響（±s，n=10）Fig.6 Effects of natural taurine on CRF（a），ACTH（b） and COR（c） contents in blood of mice（±s，n=10）

3 討論

懸尾、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是通過急性應(yīng)激誘導(dǎo)的行為絕望抑郁的經(jīng)典模型，對大部分治療抑郁的藥物均比較敏感。懸尾實(shí)驗(yàn)中被懸尾的小鼠為克服倒懸體位而不停掙扎，隨之陷入行為絕望狀態(tài)[11-12]。強(qiáng)迫游泳可使動物面對不可避免的惡劣環(huán)境，逐漸產(chǎn)生絕望狀態(tài)的一種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)[13-14]。曠場實(shí)驗(yàn)通過小鼠自主活動的情況，可以篩選出更可靠的抗抑郁藥物[15]。本研究結(jié)果表明，天然?；撬嵩?，2 g/kg bw 劑量條件下，可以顯著減少小鼠懸尾、強(qiáng)迫游泳不動時間，并增加小鼠的自主活動量，且存在劑量依賴性。結(jié)果表明天然?；撬釋毙砸钟艟哂幸欢ǖ母深A(yù)作用。

利血平誘導(dǎo)急性抑郁癥也是常用的抑郁模型之一[16]。利血平作為一種降壓藥，其副作用會對神經(jīng)遞質(zhì)水平產(chǎn)生直接影響，出現(xiàn)由于激素水平下降而引起的眼瞼下垂，體溫下降，運(yùn)動不能等假性抑郁癥狀[17-18]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，天然?；撬峥梢跃徑馍鲜鲆钟舭Y狀，表明其對利血平誘導(dǎo)的抑郁模型動物的抑郁癥狀具有一定的改善作用。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說、HPA 軸假說和BDNF 假說在抑郁癥發(fā)病機(jī)制的研究中被廣泛認(rèn)可。利血平作為一種囊泡再攝取劑，它可以通過阻礙神經(jīng)末梢內(nèi)囊泡對神經(jīng)遞質(zhì)的攝取，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸間隙5-HT、DA、NE 等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)耗竭，引起運(yùn)動不能或者體溫降低等行為以及生理上的改變，從而造成抑郁癥[19-20]。HPA 軸參與控制應(yīng)激反應(yīng)，是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分。在應(yīng)激狀態(tài)時，腎上腺功能紊亂，負(fù)反饋機(jī)制被破壞，使下丘腦能夠分泌CRF 不斷升高，CRF 可作用于腦垂體前葉，促使機(jī)體內(nèi)ACTH 分泌增強(qiáng)，接著ACTH 再作用于腎上腺，最終導(dǎo)致COR 過度分泌[21-22]，造成海馬齒狀回部神經(jīng)元損傷，引起中樞單胺遞質(zhì)紊亂，最終引發(fā)或加重抑郁癥[23]。BDNF廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，它具有神經(jīng)保護(hù)和抗細(xì)胞凋亡的作用，BDNF 水平的升高可以保護(hù)海馬神經(jīng)神經(jīng)元，防治神經(jīng)元萎縮，有研究表明，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量與BDNF 的表達(dá)有關(guān)，5-HT 等遞質(zhì)可以調(diào)控BDNF 的表 達(dá)[24]，BDNF 也可以保護(hù)5-HT 等神經(jīng)元，BDNF 的水平與抑郁程度呈負(fù)相關(guān)[25]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)天然?；撬峥梢阅孓D(zhuǎn)利血平誘導(dǎo)的急性抑郁模型小鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的下降，天然?；撬峥梢燥@著提高小鼠腦組織中NE、DA、5-HT 的含量，同時BDNF 含量也升高，表明天然?；撬峥梢酝ㄟ^提高BDNF 含量，減少海馬神經(jīng)元的萎縮和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量來改善抑郁。天然?；撬嵬瑫r降低MAO 活性與過量的CRF、ACTH、COR，恢復(fù)腎上腺的功能。因此，行為絕望和利血平引起的急性抑郁小鼠的抑郁行為機(jī)制可能與相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)濃度和功能的下降，HPA軸功能紊亂，負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制被破壞以及BDNF含量下降有關(guān)，而天然?；撬峥梢阅孓D(zhuǎn)這些改變。

4 結(jié)論與展望

天然?；撬峥梢钥s短模型動物的行為絕望時間，并且?；撬嵩?，2 g/kg bw 劑量條件下，可以緩解抑郁小鼠的眼瞼下垂，同時升高腦組織中NE、DA、5-HT 含量，減少M(fèi)AO 活性，提高BDNF水平，降低COR、ACTH、CRF 水平，表明天然牛磺酸具有預(yù)防抑郁癥的作用。

現(xiàn)代社會，人們受到來自日常緊張工作和學(xué)習(xí)的長期壓力，往往容易造成慢性抑郁。本文僅研究了?；撬釋τ诩毙砸钟舻母深A(yù)作用，而關(guān)于?；撬岣深A(yù)慢性抑郁的效果還有待繼續(xù)研究。此外，本研究結(jié)果已經(jīng)確定了牛磺酸對抗急性抑郁的功效，然而其具體干預(yù)機(jī)制并不明確。從代謝產(chǎn)物的角度去探討疾病的干預(yù)機(jī)制是目前的研究熱點(diǎn)。因此，在?；撬岣深A(yù)前、后，模型動物機(jī)體的代謝產(chǎn)物發(fā)生了哪些變化，這些差異代謝產(chǎn)物是否與改善抑郁有關(guān)，是需要進(jìn)一步探討的課題。