DPA體外抗炎活性及機制研究

鄭振霄，朱 凱，戴志遠(yuǎn)*

（1浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州 310012 2浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室 杭州 310012）3 浙江工商大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 杭州 310012）

炎癥是活體組織對有害刺激的一種保護性生理反應(yīng)，通常情況下，炎癥反應(yīng)是為了清除有害刺激并促進(jìn)傷口愈合。然而，持續(xù)的炎癥反應(yīng)會損傷機體[1-3]。由于快節(jié)奏的生活方式，導(dǎo)致出現(xiàn)更多不健康的飲食方式和不規(guī)律的作息時間，使人們體內(nèi)發(fā)生炎癥的概率大幅增加。如果炎癥得不到有效控制，很容易引發(fā)癌癥、心血管疾病和代謝疾病等惡性疾病，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[4-7]。目前，市面上用于消炎的多數(shù)為西藥制劑，這些制劑雖具有一定的消炎作用，但副作用、耐藥性等問題不容忽視。

近年來，隨著人們對n-3 多不飽和脂肪酸（n-3PUFA）研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)n-3PUFA【主要指二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳五烯酸（DPA）、二十二碳六烯酸（DHA）】之所以對人體產(chǎn)生有益作用，與它們具有的抗炎作用是分不開的。此外，n-3PUFA 是天然存在于自然界中的物質(zhì)，長期服用幾乎不會對人體產(chǎn)生毒副作用，因此，對n-3PUFA 抗炎活性及機制的研究成為熱點[8]。目前，相關(guān)研究主要集中在EPA 和DHA 上，對DPA 相關(guān)活性及機制的研究非常少。這主要是因為DPA 與EPA 和DHA 的結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似，難以獲得DPA 純品。二十二碳五烯酸（DPA）是α-亞麻酸（ALA）經(jīng)過碳鏈加長酶、去飽和酶和β-氧化代謝而成，存在于金槍魚、三文魚等深海魚類及海豹、海狗等海洋哺乳動物中，含量一般在2%～7%，此外在動物瘦肉、牛乳中也有少量分布[9]。

本文以脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7 為炎癥的體外模型，采用本實驗室自制的DPA 純品對其進(jìn)行干預(yù)，通過炎癥介質(zhì)和炎癥因子評價DPA的抗炎能力，并從NF-κB 代謝通路的角度探索DPA 體外抗炎活性機制，旨在為DPA 后續(xù)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

DPA 乙酯（純度>97%）由本實驗室自制，制備方法參考文獻(xiàn)[10]；RAW264.7 細(xì)胞，中科院上海生命科學(xué)研究院（110642）；DMEM 高糖培養(yǎng)基，?？寺∩锘瘜W(xué)制品（北京）有限公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 試劑盒，美國R&D 公司。

1.2 試劑

LPS（分析純），北京索萊寶科技有限公司；95%乙醇（分析純），杭州雙林化工試劑廠；異丙醇（分析純）、氯仿（分析純），國藥集團（上海）有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（E163302）、臺式低溫高速離心機（Micro17R），美國Thermo Fisher Scientific 公司；恒溫水浴鍋（DKS-12），上海森信實驗儀器有限公司；凈化生物超凈工作臺（YJ-840），蘇州凈化設(shè)備有限公司；倒置顯微鏡（TS2），日本尼康株式會社；PCR 儀（T100）、熒光定量PCR 儀（CFX96），美國Bio-Rad 公司。

1.4 方法

細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)：RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)液中（含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基），并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中（37 ℃，5%CO2），每2 d傳代1 次。

n-3PUFA 工作液的制備：用乙醇將EPA、DPA和DHA 溶解，配制成20 mmol/L 的母液，之后取適量母液，加到細(xì)胞培養(yǎng)液中制得60 μmol/L 的EPA、DPA 和DHA 工作液。

試驗分組：1）細(xì)胞培養(yǎng)在含有0.8 μg/mL LPS和60 μmol/L EPA 的細(xì)胞培養(yǎng)液中24 h（EPA組）；2）細(xì)胞培養(yǎng)在含有0.8 μg/mL LPS 和60 μmol/L DPA 的細(xì)胞培養(yǎng)液中24 h（DPA 組）；3）細(xì)胞培養(yǎng)在含有0.8 μg/mL LPS 和60 μmol/L DHA的細(xì)胞培養(yǎng)液中24 h（DHA 組）；4）細(xì)胞培養(yǎng)在含有0.8 μg/mL LPS 的細(xì)胞培養(yǎng)液中24 h（LPS 組）；5）細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)液中24 h（對照組）；LPS、EPA、DPA 和DHA 的作用濃度由前期的MTT 實驗確定。

NO 測定采用Griess 法；PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 分泌量的測定參照試劑盒上的說明書進(jìn)行。TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 表達(dá)量的測定采用RT-qPCR 方法。Western blot 檢測由谷歌生物科技有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

相關(guān)測定數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，采用Origin 9.0 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPA 對NO 分泌和iNOS 表達(dá)的影響

NO 是機體內(nèi)廣泛存在的氣態(tài)內(nèi)源性信號分子，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，NO 在正常細(xì)胞內(nèi)的含量很少，炎癥會誘導(dǎo)細(xì)胞合成較多的一氧化氮合酶（iNOS），產(chǎn)生大量的NO[11]。不同處理條件下細(xì)胞分泌的NO 的量如圖1a 所示，NO 在LPS 組中的分泌量最高，EPA、DPA 和DHA干預(yù)能夠顯著降低NO 的分泌量。以LPS 組NO的分泌量為100%，EPA、DPA 和DHA 處理后，NO的分泌量分別下降到46.63%，23.95%和24.81%，這說明DPA 和DHA 比EPA 更能夠抑制NO 的分泌。對照組中NO 的分泌量最低，僅為LPS 組的5.16%。由于NO 是由iNOS 誘導(dǎo)產(chǎn)生，不同分組中iNOS 的表達(dá)水平通過Western blot 方法檢測，結(jié)果如圖1b 所示，結(jié)果與NO 分泌量結(jié)果相似。

圖1 DPA 對NO 產(chǎn)量及iNOS 表達(dá)的影響Fig.1 Effect of DPA on the production of NO and expression of iNOS

2.2 DPA 對PGE2 分泌和COX-2 表達(dá)的影響

PGE2 是類花生酸中的重要成員，對炎癥的發(fā)生和發(fā)展具有很強的誘導(dǎo)作用，可以間接反映體內(nèi)炎癥反應(yīng)的強度，由花生四烯酸在環(huán)氧合酶-2（COX-2）催化下生成[12-13]。不同處理對細(xì)胞中PGE2 分泌的影響如圖2a 所示。LPS 組中PGE2的分泌量最高，EPA、DPA 和DHA 處理后PGE2的分泌量均有顯著下降。以LPS 組中的分泌量為100%，EPA、DPA 和DHA 處理后，PGE2 的分泌量分別下降到52.24%，38.18%和42.31%，這說明DPA 抑制PGE2 分泌的能力最強，DHA 次之，EPA最弱。不同處理對細(xì)胞中COX-2 表達(dá)的影響如圖2b 所示，結(jié)果與PGE2 結(jié)果具有一致性。

圖2 DPA 對PGE2 產(chǎn)量及COX-2 表達(dá)的影響Fig.2 Effect of DPA on the production of PGE2 and expression of COX-2

2.3 DPA 對炎癥因子分泌量的影響

不同處理條件對細(xì)胞中炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10）分泌的影響如圖3所示。對于TNF-α，LPS 組中的分泌量最高，EPA、DPA 和DHA 處理后，細(xì)胞中TNF-α 的分泌量均有下降，其中DPA 和DHA 的抑制作用強于EPA，而兩者之間沒有顯著差異（P<0.05）。IL-1β 在LPS 組中的分泌量最高，EPA、DPA 和DHA 處理均可以有效抑制其分泌，其中DPA 的抑制能力最強，DHA 次之，EPA 較弱。IL-6 在LPS 組中的分泌量也最高，EPA、DPA 和DHA 處理均可以顯著抑制其分泌，而三者之間無顯著差異（P<0.05）。對于抗炎因子IL-10 來講，其分泌量在LPS 組中最低，EPA、DPA和DHA 處理組中的分泌量顯著高于LPS 組，其中DPA 組的含量要顯著高于EPA 和DHA 組。

圖3 DPA 對炎癥因子產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of DPA on the production of inflammatory cytokines

2.4 DPA 對炎癥因子mRNA 表達(dá)的影響

不同處理對炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10）mRNA 表達(dá)量的影響如圖4所示。促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA 表達(dá)量在LPS組中均最高，EPA、DPA 和DHA 處理后，促炎因子mRNA 表達(dá)量均有所下降，其中DPA 處理對IL-1β 的基因表達(dá)量的抑制作用最強，顯著強于EPA和DHA。對于抗炎因子IL-10，其基因的表達(dá)量在LPS 組中最低，在DPA 組中最高，其次是DHA 和EPA。

圖4 DPA 對炎癥因子mRNA 表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of DPA on mRNA expression of inflammatory cytokines

2.5 DPA 對NF-κB 代謝通路的影響

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（Nuclear transcription factor-κB，NF-κB） 是一類關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子，通常以二聚體（p50 和p65）非活性形式存在于幾乎所有類型細(xì)胞的胞質(zhì)中，具有十分重要的功能。它與免疫細(xì)胞的活化、T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞的發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞活動有關(guān)，正常情況下，NF-κB 與其遏制蛋白IκB 在胞漿中以無活性的三聚體形式存在，炎癥發(fā)生時，NF-κB發(fā)生磷酸化激活，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核，與NF-κB 反應(yīng)性基因的κB 位點結(jié)合激活細(xì)胞中的促炎基因，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[14-17]。因此，檢測p50和p65 的磷酸化水平可以反映細(xì)胞中NF-κB 代謝通路的活化水平，從而反映炎癥反應(yīng)水平。DPA對NF-κB 代謝通路中p50 和p65 的磷酸化水平的影響如圖5所示。LPS 組中p50 的磷酸化水平最高，p-p50/p50 的值高達(dá)0.67，顯著高于其它組；EPA、DPA 和DHA 干預(yù)可以顯著抑制p50 的磷酸化，其中DPA 對p50 磷酸化的抑制作用最明顯（p-p50/p50 的值為0.12），DHA 次之（p-p50/p50的值為0.24），EPA 最弱（p-p50/p50 的值為0.37）。p65 的檢測結(jié)果和p50 具有一致性。

圖5 DPA 對p50（a）和p65（b）磷酸化的影響Fig.5 Effect of DPA on the phosphorylation of p50（a） and p65（b）

3 討論

本文以LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞為炎癥的體外模型，采用DPA 對其進(jìn)行干預(yù)，并以炎癥介質(zhì)（NO 和PGE2）和炎癥因子（TNF-α，IL-1β，IL-6 和IL-10）的分泌量為指標(biāo)，評價了DPA 的體外抗炎活性，然后從NF-κB 代謝通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化角度探索了DPA 抗炎的作用機制，為DPA 功能的開發(fā)及后續(xù)研究提供了參考。

在炎癥反應(yīng)過程中，LPS 作為一種內(nèi)毒素會導(dǎo)致促炎介質(zhì)NO 和PGE2 的過量分泌，其中NO是由iNOS 作為限速酶參與合成的，而PGE2 則是由COX-2 作為限速酶參與合成的。NO 是炎癥反應(yīng)中的重要炎癥介質(zhì)，無論急性炎癥反應(yīng)或慢性炎癥反應(yīng)過程都會伴隨NO 的過量分泌[18]，因此NO 和iNOS 常用來評價炎癥反應(yīng)的發(fā)生程度。PGE2 是類花生酸中的重要一員，是花生四烯酸（AA）經(jīng)COX-2 合成的[19]，對炎癥具有一定促進(jìn)作用。因此，PGE2 和COX-2 產(chǎn)量可以反映炎癥反應(yīng)的強度。在本文中，通過LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞作為炎癥的體外模型，并以NO、PGE2、iNOS 和COX-2 為指標(biāo)評價了DPA 的體外抗炎效果，并與EPA 和DHA 進(jìn)行比較，結(jié)果表明，DPA 和DHA均具有明顯的抗炎效果，這種效果強于EPA。

除了NO、PGE2 這些炎癥介質(zhì)外，促炎因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）和抗炎因子（IL-10）之間的平衡在炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮了很重要的作用。TNF-α 是炎癥因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子，可以誘導(dǎo)IL-1β 和IL-6 的產(chǎn)生，增強巨噬細(xì)胞的敏感性。此外，TNF-α 是一種內(nèi)生性的致熱源，可以導(dǎo)致發(fā)熱，刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌一系列的炎癥因子，這些物質(zhì)反過來又會誘導(dǎo)TNF-α 的產(chǎn)生。IL-1 是最早發(fā)現(xiàn)的白介素，幾乎所有的體細(xì)胞都可以合成該因子，而巨噬細(xì)胞是它的主要合成場所。IL-1 有ILα 和IL-β 兩種，其中IL-1β 最為常見，對中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞有趨化作用，大量的IL-1β 進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)引起發(fā)熱。此外，IL-1β 還可以刺激免疫細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，激活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控與炎癥相關(guān)代謝通路。因此，IL-1β 是體內(nèi)誘導(dǎo)作用最強的炎癥介質(zhì)之一，是調(diào)控局部和全身炎癥中關(guān)鍵的炎性細(xì)胞因子。IL-6 是一類分子質(zhì)量在21～28 ku 之間的糖蛋白，IL-6 在炎癥反應(yīng)中的作用機制復(fù)雜，它既可以觸發(fā)促炎的級聯(lián)反應(yīng)，同時又參與抗炎反應(yīng)，然而多數(shù)研究認(rèn)為過量的IL-6會起到促炎作用。IL-10 是由巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多種功效的抗炎因子，它的抗炎作用是通過抑制NF-κB 信號通路的活化，降低促炎因子TNF-α、IL-1β 等的釋放而發(fā)揮作用的。此外，IL-10 在臨床上經(jīng)常作為判斷病毒性流感、腎小球疾病、慢性腎衰竭尿毒癥及HIV發(fā)生程度的指標(biāo)。正常情況下，機體中的促炎和抗炎因子處在一種動態(tài)平衡的狀態(tài)，當(dāng)受到外界有害因素誘導(dǎo)時，促炎因子的合成量會大幅增加，抗炎因子的合成會相應(yīng)減少，這樣就導(dǎo)致機體炎癥的發(fā)生，嚴(yán)重時會誘發(fā)相關(guān)病變[20]。本研究通過分析樣品中炎癥因子分泌量及相應(yīng)mRNA 表達(dá)量的差別，評價了DPA 的抗炎效果，并與EPA 和DHA 進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)DPA 可以有效降低促炎因子mRNA 的表達(dá)及合成，增加抗炎因子mRNA 的表達(dá)及合成，此外，DPA 在抑制IL-1β 和促進(jìn)IL-10方面獨具特效。

為進(jìn)一步解釋DPA 抗炎的分子機制，以與炎癥密切相關(guān)的NF-κB 信號通路為切入點，研究了DPA 等n-3PUFA 對該信號通路中關(guān)鍵蛋白p50和p65 磷酸化的影響。結(jié)果表明，DPA 可以通過抑制NF-κB 信號通路上的IκB 降解，進(jìn)而抑制p50/p65 入核與炎癥基因作用位點的結(jié)合發(fā)揮抗炎功效，并且這種抑制效果要顯著強于EPA。然而，n-3PUFA 抗炎的分子作用機制十分復(fù)雜，涉及到多種機制的共同作用。新的研究表明，DPA 等n-3PUFA 在代謝過程中可以產(chǎn)生消散素、保護素等特殊的消退介質(zhì)（Specialized pro-resolution mediators，SPMs），這些介質(zhì)可以通過抑制NF-κB 信號通路的活化，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性，增加對炎癥因子的吞噬作用而發(fā)揮強的抗炎功效[21-22]。Arita 等[23]采用EPA 來源的消退素RvE1 對大鼠結(jié)腸炎進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明RvE1 可以顯著提高大鼠的存活率，維持大鼠體重，改善組織病理評分，降低白細(xì)胞浸潤，下調(diào)促炎因子，如TNF-α、IL-12 以及NOS 基因的表達(dá)。Janakiram 等[24]的研究表明這些特殊的消退介質(zhì)可以顯著緩解皮膚炎癥、腹膜炎和樹突細(xì)胞轉(zhuǎn)移等癥狀，在結(jié)腸炎方面，甚至可以緩解結(jié)腸炎向癌癥的轉(zhuǎn)變。此外，不同的n-3PUFA 產(chǎn)生SPMs 途徑不同，產(chǎn)物也不盡相同，有研究表明這些消退介質(zhì)所發(fā)揮的抗炎功效甚至比它們的前體還要強[25]。因此，EPA、DPA 和DHA 在抗炎功效方面的差異也很有可能與它們代謝所產(chǎn)生的SPMs不同有關(guān)。

4 結(jié)論

本文以LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 為炎癥的體外模型，研究了DPA 的體外抗炎特性，并與EPA 和DHA 進(jìn)行比較。結(jié)果表明，DPA 可以通過調(diào)節(jié)炎癥因子（TNF-α，IL-1β，IL-6 和IL-10）和炎癥介質(zhì)（NO 和PGE2）的分泌發(fā)揮抗炎作用，并且，DPA 在抑制促炎物質(zhì)IL-1β 和PGE2 以及促進(jìn)抗炎物質(zhì)IL-10 的分泌方面獨具特效。Western-blot的結(jié)果表明，DPA 可以有效抑制NF-κB 信號通路中p50 和p65 的活化，這可能是其發(fā)揮抗炎效果的分子作用機制。