苦瓜桑葉復合顆粒對高脂飲食誘導肥胖大鼠脂糖代謝及腸粘膜屏障異常的改善作用

程曉曉，張邈馨，王 嫚，耿旭芳，胡京藝，王 振，高佳萌，王亞文，李 麗，趙 丁

（河北醫(yī)科大學藥學院，河北石家莊 050017）

肥胖（obesity）是體內(nèi)脂肪積聚過多而致體重超常的一種慢性疾病[1]。隨著人們飲食習慣及生活方式的改變，肥胖發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]，并會引起糖尿病、冠心病、動脈粥樣硬化等多種代謝性疾病，危害人類健康[3]。目前已上市減肥藥多存在導致惡心、嘔吐、便秘、降低血糖等副作用，因此，開發(fā)安全性高、毒副作用低的減肥藥物及保健產(chǎn)品是很有必要的?！八幨惩础鳖愔兴幨且活惣瓤勺魉幱糜挚墒秤玫闹兴?，兼顧安全、營養(yǎng)、保健和治療的功能。因其安全性高，副作用小，在世界范圍內(nèi)廣受歡迎，亦對減肥藥物及保健產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。

苦瓜（bitter melon）是葫蘆科苦瓜屬植物苦瓜（Momordica charantia）的未成熟果實, 廣泛種植于中國及東南亞國家，是一味傳統(tǒng)的藥食同源類中藥。苦瓜含有苦瓜皂苷、苦瓜多糖、苦瓜蛋白、多肽和黃酮等多種生物活性成分，具有較高的營養(yǎng)、保健及藥用價值，可降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及抗病毒等，對糖尿病、心臟病等均有一定治療作用[4?6]。桑葉（mulberry leaf）是?？浦参锷洌∕ori folium）的干燥葉，內(nèi)含多種維生素、微量元素、氨基酸、黃酮及生物堿，亦具有降血糖、降血脂、減肥等功效[7?9]。研究證明，苦瓜、桑葉合用可有效調(diào)控正常小鼠及糖尿病小鼠的血糖血脂水平[10?13]，且未見毒副作用[14]，顯示出較好的安全性。苦瓜、桑葉等藥食同源類中藥，安全有效，其共同作用將更有利于脂糖代謝紊亂相關疾病的預防[15?16]。然而，雖然苦瓜、桑葉在調(diào)節(jié)脂糖代謝中具有重要作用，但兩者合用治療肥胖的相關研究，目前尚未見報道，有待進一步探索。

基于此，本研究將苦瓜、桑葉合用，聯(lián)合其他幾味相同功效藥食同源類中藥（葛根、金銀花等[17?19]），共同制成苦瓜桑葉復合顆粒，以此為研究對象，采用高脂飲食引起的肥胖大鼠模型，進一步考察苦瓜桑葉復合顆粒對肥胖大鼠脂糖代謝及腸粘膜屏障異常的改善作用。通過體重、血糖血脂水平、肝腸組織病理切片及腸粘膜蛋白表達等多方面檢測，探討苦瓜桑葉復合顆粒改善肥胖的作用機制，為苦瓜、桑葉合用制劑的開發(fā)及應用提供數(shù)據(jù)支持及方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級SD大鼠 雄性，體重200～250 g，由河北省實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（冀）2018-004；基礎飼料、高脂飼料 河北醫(yī)科大學實驗動物中心；RIPA裂解液、PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride）、5×蛋白上樣緩沖液（還原型）、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、PBS、BSA、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、吐溫?20（Tween-20）、HRP標記的山羊抗兔二抗、Anti-Occludin抗體、Anti-GAPDH抗體 武漢賽維爾生物科技有限公司；苦瓜桑葉復合顆粒 河北康平健康產(chǎn)業(yè)有限責任公司。

PL-203電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；JY92-IIn超聲細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；KH-III全自動研磨儀 武漢賽維爾生物科技有限公司；Epoch全波長酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；Chemray 240全自動生化分析儀 深圳雷杜生命科技股份有限公司；RM2135型切片機 德國LEICA公司；CX31型顯微鏡 日本Olympus公司；Bio-Rad小型垂直電泳轉印系統(tǒng)（包括垂直電泳槽、轉印芯及基礎電源）、ChemiDocTM XRS+凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦瓜桑葉復合顆粒的制備 苦瓜桑葉復合顆粒由河北康平健康產(chǎn)業(yè)有限責任公司制備，配方包括苦瓜、桑葉、百合、山藥、葛根、山楂、甜葉菊（質(zhì)量比為250:150:24:50:60:40:7）。制備步驟如下：稱取原料混合，以料液比1:10加入蒸餾水，加熱回流提取1.5 h，過濾得濾液，藥渣加8倍量蒸餾水加熱回流提取45 min，過濾，合并兩次濾液，得總提取液。總提取液減壓濃縮至相對密度1.09～1.1，加原料量10%的麥芽糊精，噴霧干燥，收集噴霧干燥粉，即得本實驗用苦瓜桑葉復合顆粒。

1.2.2 大鼠肥胖模型建立 32只SD雄性大鼠，適應性飼養(yǎng)一周后，隨機分為空白對照組、高脂肥胖模型組、苦瓜桑葉復合顆粒低劑量組和苦瓜桑葉復合顆粒高劑量組，每組8只?？瞻讓φ战M（Control）給予基礎飼料，高脂肥胖模型組（Model）及苦瓜桑葉復合顆粒低、高劑量組（Low dosage、High dosage）均喂養(yǎng)高脂飼料（河北醫(yī)科大學實驗動物中心監(jiān)制；主要成分質(zhì)量比：豬油11.0%，蛋黃8.0%，膽固醇1.5%及基礎飼料79.5%）。苦瓜桑葉復合顆粒低、高劑量組在給予高脂飼料的同時，按照大鼠體重比，每日分別灌胃0.5及1 g/kg苦瓜桑葉復合顆粒，給藥8周；空白對照組及高脂肥胖模型組以相同方法灌胃等體積生理鹽水。飼養(yǎng)溫度20～24 ℃，12 h 明暗輪換。第8周結束后，獲取實驗材料用于后續(xù)分析。

1.2.3 大鼠體重監(jiān)測 每周記錄大鼠體重，自由攝食、飲水。

1.2.4 血糖血脂檢測 第8周結束后，所有大鼠禁食不禁水過夜，10%（m/v）水合氯醛腹腔注射（100 μL/10 g）麻醉，腹主動脈取血，室溫放置30 min后，3000 r/min離心10 min，收集血清，于?80 ℃保存?zhèn)溆茫谎牵ㄆ咸烟?、糖化血清蛋白）、血脂（總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇）等生化指標采用全自動生化分析儀測定[20]。

1.2.5 組織形態(tài)學觀察 取各組大鼠肝臟及結腸組織，經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟制成蠟塊。使用輪轉式切片機制作大鼠肝臟組織切片及結腸組織切片，對其進行蘇木精-伊紅染色（HE染色），并通過光學顯微鏡觀察大鼠肝臟及結腸組織形態(tài)[21?22]。

1.2.6 大鼠結腸粘膜緊密連接蛋白Occludin檢測

1.2.6.1 蛋白樣本制備 取結腸樣本加入RIPA裂解液（含1% PMSF），使用裂解儀（3 mm×3 mm鋼珠，60 Hz，120 s）進行裂解，冰浴孵育30 min，4 °C，12000 r/min離心10 min，取上清，加入5×蛋白上樣緩沖液（還原型），體積為蛋白樣品的1/4，渦旋后100 ℃水浴5 min，降至室溫后置于?20 ℃保存。

1.2.6.2 Western Blot免疫印跡檢測 配制10%SDS分離膠，蛋白上樣量為20～35 μg，進行SDSPAGE電泳，60～80 V。電泳結束后，將含目標蛋白的SDS膠條帶利用濕轉法將目標蛋白轉移至已經(jīng)甲醇活化的0.22 μm PVDF膜上，電壓為110 V，轉膜時間為100 min。PVDF膜轉移于5% BSA封閉液中室溫振蕩封閉2 h。分別加入Anti-GAPDH抗體（1:4000）及Anti-Occludin抗 體（1:3000）室 溫 振蕩孵育2 h后，4 ℃過夜孵育。TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗兔抗室溫孵育2 h，按上述方法用TBST洗滌。加ECL顯色液利用化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進行成像。

1.2.6.3 半定量分析 采用Image Lab分析軟件對目標蛋白條帶進行采集分析，并通過灰度值進行半定量計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad Prism 5軟件進行數(shù)據(jù)分析，測定結果以平均值±標準誤（Mean±SEM）表示。采用ttest進行各組間差異分析，以P＜0.05為差異顯著。與肥胖模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 苦瓜桑葉復合顆粒對肥胖大鼠體重的影響

由表1可知，隨著時間的推移，各組大鼠體重均呈增加狀態(tài)。在第6周后，肥胖模型組大鼠的體重極顯著高于空白對照組（P＜0.01）；苦瓜桑葉復合顆粒低劑量組大鼠在第4周后，體重顯著低于肥胖模型組（P＜0.05）；苦瓜桑葉復合顆粒高劑量組大鼠在第5周后，體重顯著低于肥胖模型組（P＜0.05）。結果顯示，苦瓜桑葉復合顆粒低劑量組及高劑量組，均可將高脂飲食引起的體重增加恢復至正常水平，并與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05）。綜上結果表明，苦瓜桑葉復合顆?？捎行Э刂品逝执笫蟮捏w重增高現(xiàn)象，提示其對高脂飲食誘導肥胖大鼠的糖脂代謝紊亂現(xiàn)象有潛在調(diào)節(jié)能力。

表1 桑葉苦瓜復合顆粒對高脂飲食誘導的肥胖大鼠體重的影響（n=8,g）Table 1 Effects of the composite granules of bitter melon and mulberry leaf （CGBM） on the body weight of high-fat diet-induced obese rats （n=8,g）

2.2 苦瓜桑葉復合顆粒對肥胖大鼠血糖及血脂的影響

對各組大鼠的血糖及血脂進行檢測，葡萄糖（GLU）、糖化血清蛋白（GSP）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）檢測結果見圖1。

圖1 苦瓜桑葉復合顆粒對肥胖大鼠血清葡萄糖（A）、糖化血清蛋白（B）、總膽固醇（C）、甘油三酯（D）、高密度脂蛋白膽固醇（E）及低密度脂蛋白膽固醇（F）的影響Fig.1 Effects of CGBM on the serum GLU （A）, GSP （B）, TC （C）, TG （D）, HDL-C （E） and LDL-C （F） in high-fat diet-induced obese rats

結果顯示，與空白對照組大鼠相比，肥胖模型組大鼠血清中GLU和GSP含量顯著升高（P＜0.05）。給予苦瓜桑葉復合顆粒后，低劑量組及高劑量組大鼠血清GLU和GSP水平顯著降低（P＜0.05），并可恢復至正常值。

與空白對照組大鼠相比，肥胖模型組大鼠血清HDL-C含量顯著升高（P＜0.05）。給予苦瓜桑葉復合顆粒后，肥胖大鼠血清HDL-C含量有所降低，并可逐步恢復至正常水平。與空白對照組大鼠相比，肥胖模型組大鼠血清LDL-C含量顯著降低（P＜0.05）。給予苦瓜桑葉復合顆粒后，肥胖大鼠血清LDL-C含量回升，高劑量下大鼠血清LDL-C水平可恢復至正常值。血清TC、TG含量在各組大鼠間均無顯著性差異（P＞0.05）。前期研究指出，苦瓜可下調(diào)細胞內(nèi)PPAR-γ的表達，減少細胞內(nèi)的脂肪堆積，進而調(diào)控并改善肥胖引起的糖脂代謝異?，F(xiàn)象[23?24]。其中PPAR-γ是一種脂肪細胞發(fā)育的重要調(diào)控因子，在脂肪細胞，血管平滑肌細胞等多種細胞中廣泛表達[25]，而苦瓜桑葉復合顆粒改善肥胖糖脂代謝紊亂現(xiàn)象的機制亦可能與調(diào)控PPAR-γ表達有關，但有待進一步研究。

2.3 苦瓜桑葉復合顆粒對肥胖大鼠肝臟組織形態(tài)的影響

肝臟作為機體的代謝器官，在脂肪的合成、轉運等多方面具有重要調(diào)節(jié)作用[26]。將各組大鼠肝臟組織切片進行HE染色，結果如圖2所示。肥胖模型組大鼠肝臟組織脂肪滴增多，空泡化加重。給予苦瓜桑葉復合顆粒后，肝臟組織空泡化減輕，脂肪滴減少，肝臟脂肪變性有所改善。高脂飲食易引起脂質(zhì)代謝動態(tài)失衡，導致肝臟攝取游離脂肪酸增加或甘油三酯運轉障礙，最終導致甘油三酯堆積在肝臟細胞中，發(fā)生肝臟脂肪變性[27]?？喙仙Ｈ~復合顆粒可減少高脂飲食引起的肝臟脂肪變性現(xiàn)象，再次提示其對調(diào)節(jié)肥胖大鼠脂質(zhì)代謝的重要作用。

圖2 苦瓜桑葉復合顆粒對大鼠肝臟組織形態(tài)的影響（HE染色，200×）Fig.2 Effects of CGBM on the pathological changes of liver tissues in high-fat diet-induced obese rats （H&E staining, 200×）

2.4 苦瓜桑葉復合顆粒對肥胖大鼠結腸粘膜組織形態(tài)的影響

各組大鼠結腸粘膜組織切片HE染色結果（圖3）顯示，空白對照組結腸粘膜層腺體排列整齊、直立、緊貼粘膜肌層。肥胖模型組結腸粘膜腺體形狀萎縮，數(shù)量減少或消失，腺體間距增大，腺體底部與粘膜下的肌層距離增加?？喙仙Ｈ~復合顆粒給藥組的腺體形狀有所恢復，與空白對照組的腺體相似。以上結果表明，高脂飲食引發(fā)的肥胖可造成大鼠結腸粘膜形態(tài)發(fā)生改變，而苦瓜桑葉復合顆?？筛纳品逝执笫蟮哪c粘膜腺體形態(tài)、數(shù)量及肌層狀態(tài)異常，具有較好修復效果。前期研究表明，肥胖可引發(fā)人類腸道菌群失調(diào)，破壞腸道粘膜屏障，進而引發(fā)炎癥[28?29]。本研究中苦瓜桑葉復合顆粒對肥胖引起的腸道粘膜損傷具有保護作用，提示其可能對腸道菌群結構及功能具有一定調(diào)節(jié)作用。

2.5 苦瓜桑葉復合顆粒對肥胖大鼠結腸粘膜緊密連接蛋白Occludin的影響

通過免疫印跡法（Western blot）對各組大鼠結腸組織緊密連接蛋白Occludin的表達進行半定量檢測，結果如圖4所示。肥胖模型組大鼠結腸粘膜Occludin蛋白表達量顯著低于空白對照組（P＜0.05），而苦瓜桑葉復合顆粒低劑量組及高劑量組均可顯著提高大鼠結腸粘膜Occludin蛋白的表達量（P＜0.05），8周后恢復至正常水平。相關研究發(fā)現(xiàn)苦瓜粉可明顯降低肥胖大鼠結腸粘膜脂代謝相關基因的表達，并顯著上調(diào)結腸緊密連接蛋白Occludin的mRNA水平[30]，另外桑葉主要成分桑黃酮G亦可緩解LPS誘導的體外腸道上皮屏障損傷[31]。以上結果提示苦瓜桑葉復合顆?？梢欢ǔ潭壬匣謴头逝忠鸬恼衬て琳蠐p傷，對結腸功能重塑及脂糖代謝有重要調(diào)節(jié)作用。

3 結論

本研究采取高脂飲食誘導的肥胖大鼠模型，探討苦瓜桑葉復合顆粒對肥胖大鼠脂糖代謝及腸粘膜屏障異常的影響。通過8周的干預治療，苦瓜桑葉復合顆?？捎行Ы档头逝执笫篌w重，改善肥胖引起的血糖血脂水平失衡現(xiàn)象，調(diào)控肥胖大鼠血清GLU、GSP、TC、TG、HDL-C及LDL-C 含量趨向正常?？喙仙Ｈ~復合顆粒亦可減少高脂飲食引起的肝臟脂肪堆積現(xiàn)象，減少肝臟脂滴產(chǎn)生。肥胖大鼠結腸粘膜完整性受到破壞，腺體損傷伴隨著緊密連接蛋白Occludin的表達減少，最終導致腸道屏障作用受損?？喙仙Ｈ~復合顆?？筛纳品逝忠鸬哪c屏障異?，F(xiàn)象，修復腸粘膜腺體、肌層及緊密連接，具有較好腸道保護作用。

苦瓜桑葉等藥食同源中藥在食品和制藥領域的應用仍處于起步階段，其益處遠沒有得到充分利用。在確保安全性的前提下，苦瓜、桑葉具有降血糖，降血脂等作用，在開發(fā)抗肥胖藥物及保健產(chǎn)品方面具有廣闊前景[32]。本研究闡述了苦瓜桑葉復合顆粒對高脂飲食誘導的肥胖大鼠疾病狀態(tài)的改善作用，從脂糖代謝及腸粘膜屏障等方面探討了其作用機制，可為后續(xù)苦瓜桑葉復合顆粒相關制劑的開發(fā)及機制研究提供數(shù)據(jù)支持及方法參考。