小蓬草乙醇提取物對葡聚糖硫酸鈉誘導的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的抗炎作用

呂芳芳，高陽陽，陳錦麗，朱曉琳，宋家樂,3,

（1.桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，廣西桂林 541100；2.廣西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，廣西南寧 530021；3.桂林醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，廣西桂林 541100）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種免疫機制失衡的慢性胃腸道疾病。臨床上主要將IBD劃分為潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩氏?。–rohn’s disease, CD）兩類。IBD患者由于腸粘膜中存在反復的慢性炎癥造成腸上皮系統(tǒng)功能的障礙，引發(fā)胃腸道粘膜組織損傷，從而導致腹痛、腹瀉及便血等癥狀，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1?2]。據(jù)流行病學調(diào)查，IBD在中國的發(fā)病率急速增加[3]。然而，IBD確切的發(fā)病機制至今尚未明確，但遺傳和環(huán)境等因素是公認的IBD主要致病因素，且與腸道免疫調(diào)節(jié)紊亂密切相關(guān)[4]。同時，又因慢性IBD與結(jié)直腸癌的發(fā)生高度相關(guān)，進而成為了研究的熱點問題之一[5]。IBD的傳統(tǒng)療法有抗炎藥物、類固醇、免疫調(diào)節(jié)劑、單克隆抗體和抗生素療法。但這類療法大多數(shù)起到暫時的效果，且還存在著嚴重的并發(fā)癥和不良藥物反應[6]。目前，一些傳統(tǒng)中草藥由于其較好的抗炎效果而引發(fā)研究者的關(guān)注[7]。

小蓬草（Conyza canadensisL.）又名小飛蓬或加拿大蓬，屬于一年生菊科屬草本植物，原產(chǎn)北美而今在全球都有發(fā)現(xiàn)[8]。近年來，植物多酚黃酮類物質(zhì)因具有較好的生物活性和安全性而被重視[9]，而小蓬草中主要富含黃酮類、生物堿類及揮發(fā)油類等植物化學成分，其生物活性和藥用價值研究已有相關(guān)的報道[10]。在中國，小蓬草雖被視為一種分布較廣的外來入侵植物[11]，但研究報道表明，小蓬草具有抗血小板凝集作用，能通過抑制血小板過度活躍改善動脈粥樣硬化等心血管疾病[12?13]。同時，小蓬草也具有抗炎[14]、抗菌[15]、抗氧化活性[12,16]和抑制兒茶酚胺分泌的作用[17]。然而，小蓬草對于UC的抗炎作用的相關(guān)研究鮮有報道。因此，本研究擬通過利用DSS誘導制備UC小鼠模型，通過觀察小蓬草乙醇提取物對UC小鼠的臨床癥狀的改善作用，對小鼠結(jié)腸組織中抗氧化酶的活性的影響以及對炎性細胞因子和炎性介質(zhì)的表達的影響，進一步探討小蓬草乙醇提取物對結(jié)腸炎的抗炎作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮小蓬草 廣西桂林市建干路藥材市場，并經(jīng)桂林醫(yī)學院藥學院生藥學教研室鑒定（室溫陰干后備用）；葡聚糖硫酸鈉（DSS，分子量：36000～50000 kDa） MP Biomedical公 司（Solon, OH,USA）；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒（R&D system，Minneapolis，MN，USA）、Trizol試 劑、OligodT18引物、鼠maloney白血病病毒（MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶、辣根過氧化物酶、RNase抑制劑、溴化乙錠（EtBr）和瓊脂糖 Invitrogen Life Technologies（Carlsbad，CA，USA）；總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他所有試劑 均為國產(chǎn)分析級；實驗動物 雄性C57BL/6J小鼠，6周齡，體重16～18 g，共32只，由桂林醫(yī)學院實驗動物中心提供，所有小鼠置于桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院普通飼養(yǎng)房，室溫條件，標準光照/黑暗（12 h/12 h）循環(huán)環(huán)境飼養(yǎng)小鼠，隨意取用食物和水。

Leica DM4B光學顯微鏡，適配Leica DFC550 CCD相機 美國Leica Microsystems Inc；Büchi-RE111旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士Büchi Labortechnik；UV-2401PC分光光度計 日本Shimadzu；Applied Biosystems 2720熱循環(huán)儀 美國Thermo Fisher Scientific。

1.2 實驗方法

1.2.1 小蓬草乙醇提取物（CME）的制備 新鮮小蓬草樣本經(jīng)冷凍干燥（?80 ℃）后，研磨成細粉，加入乙醇（80%）充分攪拌，過夜，反復回流三次，合并回流液，4號濾紙（Whatman International Ltd.，Maidstone，UK）過濾。濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中于50 ℃真空濃縮，制備得到CME，儲存于?20 ℃環(huán)境中待用。

1.2.2 動物實驗 所有小鼠隨機分為正常組、模型組、低劑量與高劑量CME組共4組，每組8只。整個實驗周期內(nèi)正常組小鼠自由飲水，其余三組小鼠均予2%DSS溶液自由飲用誘導結(jié)腸炎7 d。模型組，低劑量與高劑量CME組于第1～7 d分別予0.9%生理 鹽 水，50 mg·kg?1CME和200 mg·kg?1CME灌胃。本研究所使用研究方案已由桂林醫(yī)學院動物倫理委員會審批通過（審查編號：GLMC201604002）。

1.2.3 動物疾病活動指數(shù)（DAI）評估 每日監(jiān)測所有小鼠體重、糞便稠度和糞便隱血。評分標準如下[18]：體重減失評分，體重未減輕：0分; 減輕1%～5%：1分;減輕5%～10%：2分；減輕10%～20%：3分；減輕20%以上：4分。糞便稠度評分，正常：0分；稀便：2分；水樣腹瀉：4分。糞便隱血程度評分，隱血陰性：0分；隱血陽性：2分；隱血強陽性：4分。DAI分數(shù)的范圍為0～12分。

1.2.4 結(jié)腸病理組織學觀察 實驗周期結(jié)束后，用CO2窒息處死所有實驗小鼠（處死前禁食12 h），取整段結(jié)腸組織，經(jīng)生理鹽水清洗，吸水紙吸干表面液體，測量結(jié)腸長度并稱重記錄。取部分結(jié)腸組織用10%的甲醛溶液固定，其余結(jié)腸組織置于?80 °C冰箱儲存待用。前者在乙醇中脫水并包埋在石蠟中，石蠟切片（4 μm）進行HE染色，使用Leica DM4B顯微鏡觀察組織標本并記錄圖像。

1.2.5 髓過氧化物酶（MPO）活性測定 取結(jié)腸組織50 mg置于預冷的含有0.5%十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，HTAB）的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，80 mmol·L?1，pH5.4）中均質(zhì)化，離心（4 ℃，12000×g，20 min）后取上清，加入150 μL的3, 3', 5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺（2 mmol·L?1），50 μL的H2O2（300 mmol·L?1）和250 μL PBS（pH5.4,80 mmol·L?1）后混勻并置于25 ℃溫育30 min后立即測定混合物在450 nm下的吸光度（A1）。約5 min后加入2.5 mL 的H2SO4（200 mmol·L?1）終止反應，使用UV-2401 PC分光光度計測量所得混合物在450 nm下的吸光度（A2）。依據(jù)公式：MPO活性單位=（A1?A2）/5，計算MPO活性單位，并以組織內(nèi)總蛋白量做校正[19]。

1.2.6 脂質(zhì)過氧化水平（MDA）測定 取結(jié)腸組織100 mg置于冷卻的PBS中勻漿。二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）測定法測定總蛋白質(zhì)。勻漿液與1 mL硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）（0.67%，mg·L?1）和1 mL三氯乙酸（trichloroacetic acid,TCA）（25%, mg·L?1）混合，加熱（45 min，95 ℃），離心（4 ℃，10715 r·min?1，20 min），取上清液。使用UV-2401 PC分光光度計測量復合物在535 nm下的光密度值后計算MDA水平[20]。

1.2.7 谷胱甘肽水平（GSH）測定 取結(jié)腸組織100 mg置于冷卻的PBS中勻漿。取0.5 mL勻漿與0.5 mL 10%的TCA充分混合，離心（5000×g，5 min），取0.1 mL上清液與1.7 mL磷酸鉀緩沖液（0.1 mol·L?1，pH8.0）和0.1 mL Ellman's試劑混合，反應5 min，使用UV-2401 PC分光光度計測量混合物在412 nm處的光密度后計算GSH水平[21]。

1.2.8 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定 取結(jié)腸組織100 mg置于冷PBS（5 mL，0.1 mol·L?1，pH7.4）中均質(zhì)化，離心（4 ℃，5000×g，10 min）后，按總SOD活性檢測試劑盒說明書要求，取適量上清液與試劑盒內(nèi)反應試劑混合。37 ℃孵育30 min后，使用UV-2401 PC分光光度計測量混合物在560 nm下的吸光度后根據(jù)說明書要求進行SOD活性的計算。

1.2.9 結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的測定 取結(jié)腸組織置于3 mL PBS（0.1 mol·L?1，pH7.4）在4 ℃環(huán)境下均化，離心（4 ℃，10000×g，5 min）。根據(jù)ELISA試劑盒說明書，分別測定結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

1.2.10 結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS和COX-2的mRNA表達 用Trizol試劑分離得到總RNA，加入氯仿，離心（25 ℃，13000×g，15 min）。取上清液，以1:1的比例將異丙醇與上清液充分混合，離心（13000×g，15 min）沉淀RNA。棄上清液，加入乙醇洗滌沉淀后，加入經(jīng)焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）處理的無RNase的水充分溶解RNA，使用UV-2401 PC分光光度計測量在260 nm下的吸光度，定量。制備1×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液，dNTPs（1 mmol·L?1），OligodT18引物（500 ng），MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（140 U）和RNA酶抑制劑混合物（40 U），取1 μg RNA加入等量混合物中進行逆轉(zhuǎn)錄，放入自動熱循環(huán)儀進行PCR，25～30個循環(huán)（94 ℃30 s，55 ℃ 30 s和72 ℃ 40 s）后，72 ℃下延伸8 min。PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳分離，EtBr染色，β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。使用Duncan's的多重范圍測試，通過單因素方差分析評估各組之間平均值的差異，P＜0.05表示統(tǒng)計學上有顯著差異。SAS v9.1統(tǒng)計軟件包（SAS Institute Inc.，USA）用于分析實驗中獲得的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CME對結(jié)腸炎小鼠癥狀的影響

DSS溶液誘導結(jié)腸炎模型是目前應用最為廣泛的實驗方法之一，模型的臨床癥狀、病理學表現(xiàn)和病變部位與人類UC最為相似，即出現(xiàn)典型的體重減輕，結(jié)腸短縮和腸壁增厚，并出現(xiàn)腹瀉和血便等特點[22?23]。與正常組小鼠相比，模型組能夠顯著引起結(jié)腸炎小鼠的體重減輕、結(jié)腸縮短（5.7 cm）、結(jié)腸重量/長度比以及總DAI指數(shù)顯著升高（P＜0.05）（表1）。表明自由飲用DSS溶液能引起小鼠出現(xiàn)相應的UC臨床癥狀。經(jīng)CME劑量組干預后，劑量組小鼠的各項指標較模型組小鼠均具有顯著差異性，并呈現(xiàn)出劑量效應關(guān)系（P＜0.05）（表1）。相較于模型組，CME劑量組小鼠體重呈現(xiàn)上升趨勢；小鼠結(jié)腸縮短現(xiàn)象得到有效抑制，低劑量組和高劑量組結(jié)腸長度分別恢復至7.5、8.6 cm（P＜0.05）；小鼠的結(jié)腸重量/長度比以及總DAI指數(shù)呈現(xiàn)顯著的下降趨勢（P＜0.05）。表明CME能有效改善結(jié)腸炎小鼠體重減輕、結(jié)腸縮短和腸壁增厚的現(xiàn)象，緩解結(jié)腸炎小鼠的癥狀。

表1 CME對結(jié)腸炎小鼠最終體重、結(jié)腸長度、結(jié)腸重量長度比和總DAI指數(shù)的影響Table 1 Effects of CME on the final body weight, colon length,ratio of colon weight to lengthand total DAI index of colitis mice

2.2 CME對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織學變化和結(jié)腸組織中MPO酶活性的影響

大量炎癥細胞（如中性粒細胞和巨噬細胞）浸潤結(jié)腸組織，能夠誘導粘膜破裂和潰瘍，最終引起結(jié)腸炎性腹瀉和出血[24]。如圖1A所示，正常組小鼠結(jié)腸組織切片中上皮完整，隱窩腺、基質(zhì)和粘膜下層結(jié)構(gòu)未受破壞。相反，模型組小鼠的組織切片顯示明顯扭曲的隱窩上皮、廣泛的粘膜損傷和大量炎癥細胞浸潤（圖1B）。經(jīng)CME劑量組處理能夠減輕DSS所致結(jié)腸上皮損傷，抑制炎性細胞浸潤，維持腸上皮和隱窩腺的完整（圖1C和D）。MPO是主要存在于嗜中性粒細胞的溶酶體蛋白，其活性是作為中性粒細胞浸潤組織和急性炎癥的重要生物標志物之一[25]。模型組小鼠結(jié)腸中MPO酶活性較正常組小鼠顯著升高（P＜0.05）。而高劑量CME組處理則顯著抑制了結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織中的MPO蓄積（圖1E）（P＜0.05）。結(jié)腸組織中MPO酶活性的降低代表著的中性粒細胞積聚得到抑制[26]。

圖1 CME對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織學改變（A～D；HE,×100）及結(jié)腸中MPO（E）的影響Fig.1 Effects of CME on colonic histological changes （A～D；HE,×100） and MPO （E） in colon of colitis mice

2.3 CME對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中MDA、GSH和SOD水平的影響

中性粒細胞和巨噬細胞等免疫細胞浸潤結(jié)腸組織是結(jié)腸炎的典型特征，局部炎癥反應能刺激活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的產(chǎn)生，引起生物膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，從而導致組織氧化應激損傷的發(fā)生[27?28]。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，是反映機體氧化應激的重要指標之一。此外，腸道抗氧化防御系統(tǒng)失衡與UC的發(fā)病機制有關(guān)，過量的ROS/RNS顯著破壞氧化劑/抗氧化劑平衡，如降低結(jié)腸組織中非酶性抗氧化物GSH含量和內(nèi)源性抗氧化酶SOD活性，減弱了對自由基的清除能力，加速結(jié)腸組織的炎癥反應和損傷[28?29]。

如表2所示，模型組小鼠結(jié)腸組織中的MDA水平較正常組小鼠顯著升高（P＜0.05）。經(jīng)CME劑量組處理后，低劑量組和高劑量組小鼠結(jié)腸組織中MDA水平較模型組分別降低19.5%和36.3%（P＜0.05）。與正常組小鼠相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中的GSH和SOD水平顯著降低（P＜0.05），這一結(jié)果與劉志龍等[30]的研究結(jié)果相似。而經(jīng)CME劑量組處理后，結(jié)腸組織中GSH和SOD水平顯著升高（P＜0.05），低劑量組和高劑量組GSH水平分別是模型組的1.8倍和2.3倍；SOD水平分別是模型組的1.4倍和1.7倍。結(jié)果提示小蓬草是一種良好的自由基清除劑，具有較好的抗氧化活性[12,16]。

表2 CME對結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織中MDA、GSH和SOD水平的影響Table 2 Effects of CME on the levels of MDA, GSH and SOD in colon tissue of colitis mice

2.4 CME對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響

TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等促炎細胞因子分泌水平異常升高是導致結(jié)腸組織炎性損傷的主要原因之一[31]。如表3所示，較正常組小鼠相比，模型組小鼠的結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6分泌水平顯著提高（P＜0.05）。高劑量CME組干預處理后，能顯著抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的異常分泌（P＜0.05）。低劑量組和高劑量組能使TNF-α水平分別較模型組降低7.0%和19.7%；IL-1β水平分別降低20.4%和32.5%；IL-6水平分別降低10.1%和24.3%。表明CME能夠抑制促炎因子的釋放，減輕結(jié)腸炎的炎性反應。

表3 CME對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響Table 3 Effects of CME on the levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in colon tissue of colitis mice

2.5 CME對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達的影響

結(jié)腸黏膜組織中炎性細胞因子異常表達在IBD的病理過程中起著重要作用。單核-巨噬細胞分泌的TNF-α是炎癥級聯(lián)反應中主要的促炎因子之一，能通過募集并激活中性粒細胞，釋放炎性因子，導致UC患者結(jié)腸粘膜炎性損傷[31?32]。IL-1β和IL-6也是UC炎癥進展的關(guān)鍵因子，抑制IL-1β不僅能減輕結(jié)腸炎癥狀，且還能抑制IL-6的過度表達[33]。如圖2所示，與正常組相比，DSS處理能引起小鼠結(jié)腸組織中的TNF-α，IL-1β和IL-6的mRNA表達顯著增強（P＜0.05）。經(jīng)低劑量和高劑量的CME干預后能顯著降低結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達（P＜0.05）。而抑制結(jié)腸組織中炎性細胞因子的過度表達對IBD防治具有重大意義[34]。

圖2 CME對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達的影響Fig.2 Effects of CME on the mRNA expression of TNF-α,IL-1β and IL-6 in colon tissue of colitis mice

2.6 CME對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中iNOS和COX-2 mRNA表達水平的影響

iNOS和COX-2是炎癥信號通路中的經(jīng)典酶，其過度表達與UC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[35]。腸粘膜中iNOS和COX-2的異?；罨芊謩e促進炎性介質(zhì)NO和PGE2的釋放，加劇UC癥狀[36]。如圖3所示，模型組小鼠結(jié)腸組織中的iNOS和COX-2的mRNA表達水平較正常組顯著上升（P＜0.05）。而高劑量CME組干預后，結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中iNOS和COX-2的mRNA表達水平顯著低于模型組（P＜0.05）。抑制iNOS和COX-2的過度表達能有效減輕腸黏膜中炎癥水平，控制IBD的發(fā)展[37]。表明CME對結(jié)腸炎可能具有較好的抗炎作用。

圖3 CME對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中iNOS和COX-2的mRNA表達的影響Fig.3 Effects of CME on the mRNA expression of iNOS and COX-2 in colon tissue of colitis mice

3 結(jié)論

本研究利用DSS誘導構(gòu)建UC小鼠模型來研究CME對結(jié)腸炎小鼠的抗炎作用效果。實驗結(jié)果提示，CME能有效改善結(jié)腸炎小鼠體重減輕、結(jié)腸縮短和腸壁增厚的現(xiàn)象，緩解結(jié)腸炎小鼠的癥狀。通過提高結(jié)腸組織中抗氧化物質(zhì)GSH和SOD的活性，進一步減輕結(jié)腸粘膜中的氧化應激損傷。同時，CME還能明顯抑制結(jié)腸組織中MPO酶活性以及抑制結(jié)腸組織中炎性細胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的異常分泌和炎性介質(zhì)（TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS和COX-2）的過度表達。綜上所述，CME對結(jié)腸炎可能具有較好的抗炎作用，能夠修復結(jié)腸炎的炎癥反應，故可進一步為小蓬草的開發(fā)利用及結(jié)腸炎的臨床研究提供支持。