玫瑰花冠茶總黃酮提取的工藝優(yōu)化

孫 瑤，朱雅婧，李 武，趙付安

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所,河南 鄭州 450002）

玫瑰（Rosa rugosa Thunb.）屬薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa Linn.）落葉灌木，花色豐富，香味或濃厚，或淡雅，深受大家喜愛[1]。常見玫瑰是大馬士革、保加利亞等品種，國際市場主流的玫瑰產(chǎn)品如精油等[2]，均以這些品種的提取物作為國際標(biāo)準(zhǔn)，因此國產(chǎn)玫瑰提取物難以進(jìn)入國際高端化妝品市場。國內(nèi)的玫瑰產(chǎn)業(yè)發(fā)展只能另辟蹊徑[3-4]，發(fā)展“藥食兩用”玫瑰產(chǎn)品，玫瑰花茶就是其中之一。我國制造玫瑰花茶已有1 000 多年的歷史。豐花玫瑰是我國自主培育的玫瑰品種，被國家輕工部規(guī)定為可食用玫瑰品種[5]。玫瑰花茶以半開放的玫瑰花品質(zhì)最佳，成品茶香氣濃郁、滋味甘美，廣受人們喜愛[6]。采用新鮮玫瑰花制成的玫瑰花茶調(diào)理血?dú)?、養(yǎng)顏美容，長期飲用亦有助于促進(jìn)新陳代謝，主要原因是其富含黃酮[7]。黃酮是2 個(gè)酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子連結(jié)形成的一系列化合物的統(tǒng)稱，是一種很強(qiáng)的抗氧劑，抗氧化作用可以阻止細(xì)胞的退化、衰老，也可阻止癌癥[8]的發(fā)生。不同分子結(jié)構(gòu)的黃酮可作用于身體不同的器官，可有效清除體內(nèi)的氧自由基，另外還具有消炎、鎮(zhèn)痛等功效[9]。

黃酮普遍存在于各種植物中[10]，如洋蔥[11]、大蔥[12]、荔枝[13]、板栗殼[14]及各種中草藥[15-17]等。不同植物中的黃酮成分有很大不同，因此不同植物的使用功效也不太一樣。黃酮也是近年來研究的熱點(diǎn)，玫瑰中富含黃酮，玫瑰及其相關(guān)制品受到人們青睞很大程度上也是因?yàn)辄S酮的功效。目前，對(duì)黃酮提取的報(bào)道較多，有直接從植物食部提取黃酮的，也有從皮、殼[14，18]等廢料中提取黃酮回收利用的?；诿倒寤ㄖ悬S酮的強(qiáng)大功效，試驗(yàn)從玫瑰花冠茶中提取了黃酮，并通過方法改良，優(yōu)化得到了最佳提取工藝，為玫瑰黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，對(duì)玫瑰花資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

豐花玫瑰，采自河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地，60 ℃下烘干成花冠茶，粉碎過60 目篩，保存?zhèn)溆茫粴溲趸c、硝酸鋁、硝酸鈉、乙醇，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，Solarbio，貨號(hào)SR8250-100 mg。

1.2 儀器

Epoch 酶標(biāo)儀，美國Bio-tek 公司產(chǎn)品；金屬浴，金銀杏生物科技（北京）有限公司產(chǎn)品；智能超聲波清洗機(jī)，廣東固特超聲股份有限公司產(chǎn)品；Centrifuge 5424 型離心機(jī)，德國艾本德股份公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玫瑰花冠茶的制備

在5 月盛花期，摘取花瓣已經(jīng)打開不見花蕊的豐花玫瑰，早上7 點(diǎn)前摘取完畢。新鮮采摘的花冠置于空氣能熱泵中烘干，設(shè)置溫度60 ℃。

1.3.2 玫瑰花冠茶總黃酮的提取

將烘干后的玫瑰花粉碎，過60 目篩。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的干粉，加入適量體積分?jǐn)?shù)乙醇，置于65 ℃溫浴1 h，之后將粗提液置于離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心20 min，取上層清液備用。

1.3.3 黃酮提取工藝條件優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)，考查花茶和乙醇的料液比（1∶10，1∶20，1∶40，1∶60，1∶80，1∶100，1 ∶150，1 ∶200，1 ∶300）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（0，20%，40%，60%，70%，80%，90%，100%）、溫浴溫度（0，22，45，65，85 ℃）、提取時(shí)間（0，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，12.0，16 h）4 個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的結(jié)果通過測定黃酮產(chǎn)率分析條件優(yōu)劣。

1.3.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取適量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加入一定體積乙醇充分溶解，配置質(zhì)量濃度為20 mg/mL 的蘆丁溶液。取一定體積的蘆丁溶液，加蒸餾水稀釋100 倍，最終配成0.2 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。準(zhǔn)確蘆丁0.2 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液0，20，40，60，80，100 μL，分別置于干凈的1.5 mL 棕色離心管中，補(bǔ)足70%乙醇至100 μL，加入5%亞硝酸鈉25 μL，暗處靜置6 min。靜置后在體系中加入10%硝酸鋁25 μL，混合均勻，繼續(xù)暗處靜置6 min。最后在離心管中加入5%氫氧化鈉200 μL，70%乙醇150 μL，總體系500 μL，混勻后暗處靜置15 min。使用96 孔板合理布板，每個(gè)離心管設(shè)置三重復(fù)點(diǎn)板，對(duì)照組設(shè)置為不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，測定各組在510 nm 的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合得到直線方程。

1.3.5 黃酮總含量的測定

黃酮含量測定參照王剛等人[18]的測定方法，進(jìn)行一定改進(jìn)。取適量黃酮提取液于1.5 mL 離心管中，按照1.3.4 中測定方法，測定不同條件下提取的黃酮于波長510 nm 處的吸光度。將吸光度代入對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的線性方程，計(jì)算得到黃酮在500 μL 測定體系中的質(zhì)量濃度，繼而得到黃酮質(zhì)量和在原提取液中的總質(zhì)量。通過計(jì)算，最終得到提取的黃酮在花冠茶中所占的質(zhì)量比，即產(chǎn)率。

式中：OD510——黃酮的510 nm 吸光值；

V總——加乙醇后原提取液的體積，mL；

k——蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

V取——從原提取液中取用的體積，mL；

m——稱取花冠粉末的質(zhì)量，mg。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，Origin 9.1 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.3.4 中試驗(yàn)方法，離心管中分別加入0.2 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0，20，40，60，80，100 μL，則蘆丁的質(zhì)量濃度分別為0，8，16，24，32，40 μg/mL。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD510為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸光度=0.005 7×質(zhì)量濃度，R2=0.998，其中斜率k=0.005 7。

2.2 料液比對(duì)黃酮產(chǎn)率的影響

分析料液比對(duì)提取黃酮產(chǎn)率的影響，乙醇和花茶的體積質(zhì)量比（μL/μg）分別為10∶1，20∶1，40∶1，60∶1，80∶1，100∶1，150∶1，200∶1，300∶1，提取質(zhì)量完成后，取上清液，亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定黃酮濃度，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

黃酮產(chǎn)率隨料液比的變化圖見圖2。

圖2 黃酮產(chǎn)率隨料液比的變化圖

花茶和乙醇的體積質(zhì)量比初始值為1∶10，隨著料液比的增大，黃酮溶解量也在不斷增大，其產(chǎn)率也隨之增大；當(dāng)料液比達(dá)到1∶100 時(shí)，現(xiàn)有方法能夠提取出的黃酮溶解量達(dá)到最大，黃酮產(chǎn)率也達(dá)到最大；隨著料液比繼續(xù)增大，現(xiàn)有的提取方法和溶劑使得黃酮溶解量基本不變，產(chǎn)率浮動(dòng)也趨于平緩，黃酮得率維持在穩(wěn)定水平。當(dāng)料液比達(dá)到1∶100后，溶劑用量增加但黃酮產(chǎn)率卻不再變化，出于有效利用試劑和節(jié)省能耗的考慮，料液比選擇1∶100更有利于豐花玫瑰中黃酮的提取。

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮產(chǎn)率的影響

乙醇提取黃酮共設(shè)置8 個(gè)體積分?jǐn)?shù)，分別為0，20%，40%，60%，70%，80%，90%，100%，在溫浴超聲離心后，測定不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下的黃酮產(chǎn)率。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮產(chǎn)率的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮產(chǎn)率的影響

由圖3 可知，溶劑中不加入乙醇即純水溶液時(shí)，也有一定體積分?jǐn)?shù)的黃酮析出；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，黃酮析出量也增大，說明乙醇的加入有利于黃酮的溶解。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%時(shí)，黃酮的溶解度最大，產(chǎn)率最高；繼續(xù)增大乙醇的體積分?jǐn)?shù)，黃酮的產(chǎn)率直線式下跌，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)超過40%，會(huì)影響黃酮的溶解，甚至不如純水溶液中黃酮的產(chǎn)率；當(dāng)使用100%乙醇時(shí)，黃酮產(chǎn)率跌至0.89%，是產(chǎn)率的最小值。乙醇體積分?jǐn)?shù)的試驗(yàn)說明適量加入乙醇有利于黃酮的溶解，但乙醇體積分?jǐn)?shù)超過40%則抑制了黃酮的析出和溶解，因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)能夠有效提取豐花玫瑰中的黃酮。

2.4 溫浴溫度分析

控制提取條件料液比1∶100，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，溫浴1 h 條件下提取豐花玫瑰中的黃酮，溫浴溫度分別設(shè)定為0，22，45，65，85 ℃。

溫浴溫度對(duì)黃酮提取的影響見圖4。

圖4 溫浴溫度對(duì)黃酮提取的影響

由圖4 可知，在溫浴溫度為45 ℃以下時(shí)，黃酮產(chǎn)率均在4.2%左右，溫度對(duì)黃酮的溶解度影響不大；當(dāng)溫度超過45 ℃時(shí)，溶解度急劇增加，黃酮產(chǎn)率也隨之增大；溫浴溫度為85 ℃時(shí)，產(chǎn)率與65 ℃時(shí)相比，既無增大也無減小的趨勢，趨于平行。說明提取溫度在45 ℃以下，溫度不影響黃酮的溶解；溫度高于45 ℃后，黃酮溶解度急劇增大，測得產(chǎn)率增大；溫度增大到65 ℃時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到峰值；繼續(xù)提高溫度，對(duì)黃酮的溶解度沒有影響。綜合分析，提取溫度為65 ℃更有利于提高豐花玫瑰中的黃酮產(chǎn)率。

2.5 溫浴時(shí)間分析

控制提取條件料液比1∶100，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，溫浴溫度65 ℃條件下提取豐花玫瑰中的黃酮，溫浴時(shí)間分別設(shè)定為0，30，60，90，120，150，180 min。

溫浴時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響見圖5。

圖5 溫浴時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響

由圖5 可知，溫浴時(shí)間延長，產(chǎn)率也隨之增大；當(dāng)溫浴時(shí)間達(dá)到60 min 時(shí)，黃酮產(chǎn)率約為5.5%，達(dá)到最大；隨著溫浴時(shí)間繼續(xù)延長，黃酮產(chǎn)率略有降低；溫浴180 min 時(shí)，黃酮產(chǎn)率約為5.38%。綜合分析，溫浴時(shí)間為60 min 時(shí)，既能節(jié)省能源，也能最大效率地提取豐花玫瑰中的黃酮。

3 結(jié)論

黃酮廣泛存在于高等植物的花、果、葉、莖及種子中。目前，常用的黃酮提取方式有超聲波、微波輔助提取和有機(jī)溶劑浸潤的方法等。超聲提取工藝穩(wěn)定、簡單安全、成本低[19]，微波提取積小、節(jié)能、省時(shí)[20]，但無一例外，這2 種方法都需要配備超聲儀或微波儀，對(duì)設(shè)備要求較高會(huì)大大提高成本。相比較來說，有機(jī)溶劑浸潤的方式提取黃酮，同樣可以做到成本低、耗時(shí)短、提取效率高，設(shè)備上僅要求水浴鍋，完全可以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)應(yīng)用。另外，這也是目前使用較為廣泛[12，21-22]的提取方式，進(jìn)一步說明了操作方法的簡單易行。

豐花玫瑰是山東省平陰縣玫瑰所培育的玫瑰品種，1998 年通過山東省審定，具有抗旱抗病、開花率高的特點(diǎn)。試驗(yàn)從豐花玫瑰中，采取有機(jī)溶劑浸潤的方法提取花冠茶黃酮。在單因素控制條件下，主要考查影響黃酮提取的4 個(gè)因素：料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溫浴溫度及時(shí)間。4 個(gè)因素中，相對(duì)來說，料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮提取的影響最大，控制好這2 個(gè)因素，可以使黃酮的提取效率提高約6 倍（從0.89%±0.20%提高到5.31%±0.04%）；同時(shí)，控制料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)，可以更高效地利用乙醇的溶劑效應(yīng)，使得黃酮更好溶出，這2 個(gè)因素也是節(jié)省成本的關(guān)鍵?？刂茰卦囟燃皶r(shí)間可以有效提高黃酮的產(chǎn)出效率，產(chǎn)率可以從4.07%±0.35%提升到5.53%±0.26%。最終獲得最佳制備工藝：花渣中加入40%乙醇，體積為花渣質(zhì)量的100 倍，在65 ℃條件下，浸潤1 h 可以獲得豐花玫瑰最大黃酮提取效率5.50%±0.20%，為豐花玫瑰的食用價(jià)值提供理論依據(jù)。