1種布魯菌抗體檢測(cè)試紙條快速檢測(cè)方法的建立

吳志強(qiáng)，劉少蓉，白民俊，段曉珮，高 強(qiáng)，黃素文，段躍強(qiáng)*

(1.內(nèi)蒙古華希生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010111；2.北京美聯(lián)泰科生物技術(shù)有限公司，北京 100176)

布魯菌的主要傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)分別有培養(yǎng)特性的鑒定、生化檢驗(yàn)、病原分離鑒定及血清學(xué)檢測(cè)等[1]。近年來，運(yùn)用于臨床檢測(cè)布魯菌病的免疫學(xué)方法主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)和試管凝集試驗(yàn)(SAT)等[2]。SAT和RBPT操作方法簡(jiǎn)單，是我國(guó)檢測(cè)布魯菌病最通用的方法[3]，但缺點(diǎn)是容易發(fā)生交叉凝集反應(yīng)，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[4]。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)參與試驗(yàn)的因素多，操作比較復(fù)雜，試驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)。ELISA雖然診斷率高，但存在交叉反應(yīng)、試驗(yàn)干擾因素較多、重復(fù)性不好、對(duì)試劑成分及其生產(chǎn)品牌的選擇性高、難以同時(shí)區(qū)分多種病菌等缺點(diǎn)[1]。

光滑型布魯菌脂多糖(smooth lipopolysaccharide,sLPS)抗原能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)間的抗體水平，因此，sLPS抗原是布病抗體檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)抗原。目前，市售布魯菌檢測(cè)試紙條將布魯菌可溶性蛋白多糖復(fù)合物抗原作為檢測(cè)線，但是存在的問題是產(chǎn)品靈敏度稍差，漏檢概率較大。我們研制的布魯菌抗體檢測(cè)試紙條，采用了高度純化的sLPS抗原作為檢測(cè)抗原，同時(shí)利用間接法將膠體金標(biāo)記在能與哺乳動(dòng)物IgG普遍反應(yīng)的葡萄球菌蛋白A(slaphylococcal protein A,SPA)上[5]，充分發(fā)揮了膠體金試紙條敏感性高、可對(duì)不同動(dòng)物進(jìn)行布魯菌病檢測(cè)的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。

本試劑采用膠體金免疫層析法(GICA)研制了可檢測(cè)牛、羊光滑型布魯菌抗體的試紙條[6]，作為當(dāng)前獸醫(yī)臨床診斷動(dòng)疫病最簡(jiǎn)便、快速、敏感特異的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一，可廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)診斷[7]，有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 菌種與血清光滑型布魯菌脂多糖(sLPS)由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)純化；布魯菌病陽(yáng)性血清標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸桿菌陽(yáng)性血清(牛源)、大腸桿菌陽(yáng)性血清(羊源)、都柏林沙門菌陽(yáng)性血清(牛源)、都柏林沙門菌陽(yáng)性血清(羊源)、產(chǎn)氣莢膜梭菌陽(yáng)性血清(牛源)、產(chǎn)氣莢膜梭菌陽(yáng)性血清(羊源)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O：9陽(yáng)性血清(牛源)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O：9陽(yáng)性血清(羊源)、布魯菌病陰性血清(牛源)和布魯菌病陰性血清(羊源)等，均由本實(shí)驗(yàn)室制備；粗糙型布魯菌陽(yáng)性血清，由北京希牧生物技術(shù)有限公司研發(fā)中心饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑布魯菌病試管凝集試驗(yàn)抗原，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；市售布魯菌檢測(cè)試紙條，購(gòu)自浙江迪恩生物科技股份有限公司；硝酸纖維膜購(gòu)自默克公司；氯金酸購(gòu)自Sigma公司；玻璃纖維、PVC底板購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司；SPA購(gòu)自杭州紐龍生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 sLPS的粗提及精純采用熱酚水法粗提。取檢驗(yàn)合格的菌液，以8 000×g離心30 min，棄上清，測(cè)定菌體質(zhì)量，按比例加入蒸餾水，加熱至66℃，在此溫度下加入苯酚溶液(水飽和酚溶液)，持續(xù)攪拌15 min，冷卻至2～8℃。具體操作參照文獻(xiàn)[8]。

1.4 sLPS抗原的檢驗(yàn)取10 μL sLPS抗原溶液，經(jīng)SDS-PAGE后分別進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色和銀染。考馬斯亮藍(lán)染色：將電泳后的凝膠取出，置于考馬斯亮藍(lán)染色液染色4 h以上，放入脫色液中脫色數(shù)次，脫色后取出觀察分析；銀染：將電泳后的凝膠浸入固定液中，于22℃氧化固定15 min，棄去固定液清洗3次加入銀染染色液，棄染色液后將凝膠浸入顯影液，最后在10%乙酸溶液中作用1 min終止反應(yīng)。

1.5 膠體金溶液的制備及鑒定配制1%氯金酸溶液，搖勻后放到電磁爐上加熱至沸騰，迅速加入1%檸檬酸三鈉溶液，搖勻，繼續(xù)加熱10 min左右，直至溶液呈透亮的酒紅色，冷卻至室溫，用純化水恢復(fù)至原體積，分裝到棕色試劑瓶中，置2～8℃避光保存。

1.6 SPA最佳蛋白標(biāo)記量的確定將不同蛋白含量的SPA加入裝有l(wèi) mL pH7.0的膠體金溶液的1～9號(hào)離心管內(nèi)，混勻靜置，再在上述各管內(nèi)分別加入0.l mL 10%氯化鈉溶液，混勻后靜置20 min。觀察使膠體金溶液呈橙紅色未變的最小SPA 用量即為最低穩(wěn)定量，最低穩(wěn)定量的10倍即為最適SPA用量。

1.7 試紙條的制備

1.7.1質(zhì)控線(C線)和檢測(cè)線(T線)的劃膜 將兔抗SPA多克隆抗體和純化的sLPS分別作為質(zhì)控抗原和檢測(cè)抗原，按照摸索好的濃度稀釋后，使用金標(biāo)劃膜儀在NC膜噴印C線、T線。

1.7.2膠體金試紙條的組裝及結(jié)果判定 將各組分依次粘貼，組裝成試紙條，置陰涼干燥處貯存。檢測(cè)血清樣品時(shí)，C、T線同時(shí)出現(xiàn)條帶，表示為布魯菌抗體陽(yáng)性；只有C線出現(xiàn)條帶，表示為布魯菌抗體陰性；如果C線無紅色條帶出現(xiàn)，則該試紙條無效。

1.8 試紙條的檢驗(yàn)

1.8.1敏感性試驗(yàn) 用樣品稀釋液將布魯菌病陽(yáng)性血清國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 IU/mL)進(jìn)行系列稀釋，取100.00，10.00，1.00，0.10,0.01 IU/mL 5個(gè)稀釋度進(jìn)行試紙條檢測(cè)，試紙條的敏感度應(yīng)為結(jié)果呈陽(yáng)性的血清最高稀釋度。

1.8.2重復(fù)性試驗(yàn) 取同批次及3批不同批次的試紙條分別對(duì)布魯菌病陰、陽(yáng)性血清檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定試紙條的批內(nèi)和批間重復(fù)性。

1.8.3特異性試驗(yàn) 用同一批次試紙條分別檢測(cè)11種特異性質(zhì)控血清，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果觀察其特異性。

1.8.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取密封后的試紙條分別置于4,30℃的環(huán)境下保存1,3,6,9,12,15,18,21,24,27個(gè)月，取樣進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確定試紙條的穩(wěn)定性。

1.9 比對(duì)試驗(yàn)(試紙條與試管凝集試驗(yàn))用試紙條與試管凝集試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)110份牛血清和羊血清，牛、羊血清樣品由本實(shí)驗(yàn)室制備、采集和檢驗(yàn)。凝集試驗(yàn)中先將待檢血清稀釋后再加入凝集抗原反應(yīng)，根據(jù)血清凝集程度判定結(jié)果。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果比較二者的符合率。

1.10 臨床樣品檢測(cè)用試紙條檢測(cè)120份臨床樣品，分別為羊源的布魯菌病陽(yáng)性血清、牛源的布魯菌病陽(yáng)性血清、羊源的布魯菌病陰性血清和牛源的布魯菌病陰性血清，各30份，均由本實(shí)驗(yàn)室采集分離、檢驗(yàn)。將臨床樣品設(shè)盲，由不參與試驗(yàn)的人員對(duì)待檢血清進(jìn)行編號(hào)，盲底一式二份密封保存。

2 結(jié)果

2.1 sLPS抗原純度測(cè)定純化的sLPS抗原SDS-PAGE后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)，無蛋白條帶(圖1)；銀染條帶均勻分散，條帶的相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在40～60 kDa(圖2)。

M.Marker；1.脂多糖；2,3.sLPS抗原

M.Marker；1～4.sLPS抗原；5.脂多糖

2.2 膠體金表征分析當(dāng)1%氯金酸溶液與1%檸檬酸三鈉溶液的比例為1∶1.6時(shí)，肉眼觀察制備的膠體金溶液顏色為橙紅色，制備的膠體金最大吸收峰在525 nm處，膠體金粒徑大小達(dá)到要求(表1)。已知膠體金顆粒直徑在20～40 nm范圍內(nèi)最穩(wěn)定，所以，該產(chǎn)品的研發(fā)選用25 nm左右粒徑的膠體金顆粒。制備的膠體金透射電鏡表征見圖3，顆粒呈球形，分散性較好，顆粒大小均一。在自然光照下，膠體金溶液呈酒紅色，清澈透亮，室溫下放置3個(gè)月仍能保持穩(wěn)定，顏色清澈無沉淀析出。

表1 不同比例膠體金顆粒紫外檢測(cè)結(jié)果 nm

圖3 膠體金電鏡圖

2.3 試紙條的制備按照?qǐng)D4的順序，依次將試紙條各組分組裝在一起，結(jié)果按照1.7.2方法判定。

1.樣品墊；2.金標(biāo)墊；3.硝酸纖維膜：4.吸水紙；5.T線；6.C線；7.PVC板

2.4 膠體金試紙條的鑒定

2.4.1敏感性試驗(yàn)結(jié)果 用樣品稀釋液將布魯菌病陽(yáng)性血清標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 IU/mL)進(jìn)行系列稀釋，取100.00,10.00,1.00，0.10,0.01 IU/mL 5個(gè)稀釋度進(jìn)行試紙條檢測(cè)，結(jié)果顯示試紙條最低可檢測(cè)至0.1 IU/mL的布魯菌病陽(yáng)性血清，所以試紙條的靈敏度為0.1 IU/mL(圖5)，遠(yuǎn)高于虎紅平板凝集試驗(yàn)(25 IU/mL)和試管凝集試驗(yàn)(2.5 IU/mL)的最低檢出量。和市場(chǎng)上經(jīng)批準(zhǔn)銷售的同類試紙條相比，檢測(cè)靈敏性提高了100倍，表明我們的試紙條具有高靈敏性。

1.100.00 IU/mL；2.10.00 IU/mL；3.1.00 IU/mL；4.0.10 IU/mL；5.0.01 IU/mL

2.4.2重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 用同一批試紙條檢測(cè)4份陽(yáng)性血清和4份陰性血清，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果一致，詳細(xì)試驗(yàn)結(jié)果見圖6,7。用3批不同批次試紙條分別檢測(cè)4份陽(yáng)性、陰性血清，結(jié)果均一致,表明研制的試紙條批內(nèi)和批間的可重復(fù)性均為100%。

1,2.布魯菌陽(yáng)性血清(羊源)；3,4.布魯菌陽(yáng)性血清(牛源)

2.4.3特異性試驗(yàn)結(jié)果 用膠體金試紙條檢測(cè)11種特異性血清，布魯菌陽(yáng)性血清和陰性血清作對(duì)照。結(jié)果顯示，在對(duì)照組均成立的條件下，其他11種特異性血清檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明試紙條具有較好的特異性，不與其他非相關(guān)疾病感染血清反應(yīng)(圖8)。

1,2.布魯菌陰性血清(羊源)；3,4.布魯菌陰性血清(牛源)

1.大腸桿菌陽(yáng)性血清(牛源)；2.大腸桿菌陽(yáng)性血清(羊源)；3.都柏林沙門菌陽(yáng)性血清(牛源)；4.都柏林沙門菌陽(yáng)性血清(羊源)；5.粗糙型布魯菌陽(yáng)性血清；6.產(chǎn)氣莢膜梭菌陽(yáng)性血清(牛源)；7.產(chǎn)氣莢膜梭菌陽(yáng)性血清(羊源)；8.小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O：9陽(yáng)性血清(牛源)；9.小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O：9陽(yáng)性血清(羊源)；10.布魯菌病陰性血清(牛源)；11.布魯菌病陰性血清(羊源)

2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 在4,30℃不同環(huán)境溫度下儲(chǔ)存的試紙條，用同一批血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果顯示直到第27個(gè)月，試紙條各項(xiàng)性能指標(biāo)合格，仍可對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定。

2.5 比對(duì)試驗(yàn)(試紙條與試管凝集試驗(yàn))兩者對(duì)牛血清檢測(cè)，陽(yáng)性符合率為100%，陰性符合率為 95.2%，總符合率為95.4%(表2)；對(duì)羊血清檢測(cè)，陽(yáng)性符合率為97.9%，陰性符合率為93.3%，總符合率為97.2%(表3)。由此可見試紙條檢出效率符合診斷試劑的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB/T 26124-2011)。

表2 牛血清樣品檢測(cè)結(jié)果符合率

表3 羊血清樣品檢測(cè)結(jié)果符合率

2.6 臨床樣品檢測(cè)揭盲對(duì)120份臨床盲樣進(jìn)行檢測(cè)并揭盲，60份樣品為陽(yáng)性，60份樣品為陰性，檢測(cè)結(jié)果均與盲底一致，表明試紙條對(duì)于實(shí)際檢測(cè)臨床樣品具有很強(qiáng)的應(yīng)用性和準(zhǔn)確性。

3 討論

布魯菌病(簡(jiǎn)稱布病)近幾年在世界范圍內(nèi)廣泛流行，特別是在發(fā)展中國(guó)家暴發(fā)更為嚴(yán)重，也對(duì)人的健康造成極大的威脅。為此,我國(guó)緊急發(fā)布了《關(guān)于加強(qiáng)布魯菌防治工作的通知》[9]。通過對(duì)血清抗體的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病情反復(fù)發(fā)作時(shí)，機(jī)體的IgG 抗體可以迅速回升[10]。

我國(guó)動(dòng)物布魯菌病診斷技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[11](GB/T 18646-2002)介紹的布病血清學(xué)檢測(cè)方法中，虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果判定主觀性強(qiáng)，主觀差異性較大；乳牛全乳環(huán)狀試驗(yàn)僅適用于奶牛，且試驗(yàn)的操作復(fù)雜[12]。上述各種試驗(yàn)技術(shù)各有其自身的特點(diǎn)，但存在的共同缺陷是以上各種檢驗(yàn)都需要在實(shí)驗(yàn)室完成，難以在基層中推廣使用，而免疫膠體金技術(shù)克服了上述缺陷。膠體金試紙條憑借其使用方便、現(xiàn)場(chǎng)迅速判定結(jié)果等優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)物疫病檢測(cè)中已得到較廣泛的應(yīng)用[13]。

本試驗(yàn)即采用了高度純化的 sLPS 抗原作為檢測(cè)抗原，成功制備了布魯抗體檢測(cè)試紙條(膠體金法)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，我們的試紙條具有高靈敏性；重復(fù)性試驗(yàn)用3個(gè)不同批次試紙條分別檢測(cè)4份陽(yáng)性血清和4份陰性血清，檢測(cè)結(jié)果與試管凝集試驗(yàn)結(jié)果均一致，表明研制的試紙條批內(nèi)和批間可重復(fù)性均為100%，具有較好的穩(wěn)定性；特異性試驗(yàn)在保證對(duì)照組成立的條件下，檢測(cè)11份特異性血清樣品為陰性，證明試紙條特異性強(qiáng)，和有可能存在交叉的血清均沒有交叉現(xiàn)象，避免像傳統(tǒng)檢測(cè)方法易出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象。

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物布魯菌病診斷技術(shù)》(GB/T 18646-2018)中將試管凝集試驗(yàn)方法確定為標(biāo)準(zhǔn)方法，本試紙條與試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行比對(duì)，2者對(duì)牛、羊血清的檢測(cè)的符合率分別為95.4%和97.2%，由此可見試紙條檢出效率符合診斷試劑的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，可以保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性。常規(guī)檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)，本試紙條檢測(cè)樣品時(shí)僅需1～2 min即可判讀結(jié)果，不需要特殊儀器設(shè)備，不需要專業(yè)操作人員，具有敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)。穩(wěn)定性試驗(yàn)證明本試紙條在4～30℃條件下可保存長(zhǎng)達(dá)24個(gè)月，更加適合在基層農(nóng)村和小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)推廣使用。本產(chǎn)品為多種疾病聯(lián)檢試紙條的研制和多標(biāo)本快速定量檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)[14]。

本研究成功研制了布魯菌抗體檢測(cè)試紙條，它具有很高的靈敏性、特異性、重復(fù)性，這一研究結(jié)果為基層進(jìn)行快速動(dòng)物疾病檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。