蠶砂炒炭前后對小鼠出血和凝血時間的影響

★ 李瑩 黃金穗 徐媛 熊之琦 張志紅 葉喜德（.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌0006；.南昌醫(yī)學(xué)院 南昌 0004；.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 0004；4.江西省兒童醫(yī)院 南昌0006）

蠶砂來源于蠶蛾科昆蟲家蠶（Bombyx moriL.）幼蟲的干燥糞便［1］，別名蠶矢，臨床常以晚蠶之屎質(zhì)佳，又稱晚蠶砂，或原蠶砂。其味甘辛、性溫，入肝、脾胃經(jīng)，具祛風(fēng)除濕，和胃化濁，活血通絡(luò)之功。蠶砂臨床應(yīng)用歷史悠久，始載于《名醫(yī)別錄》曰：“主腸鳴，熱中消渴，風(fēng)痹，癮疹?！保?］從歷代本草的記載來看，蠶砂主治半身不遂、中風(fēng)、腸鳴、消渴癥、血崩和血虛等。蠶砂主含生物堿類、黃酮類、木質(zhì)素類、萜類、氨基酸、植醇和葉綠素鹽及其他等，具有抗腫瘤、保肝、抗病毒、補血、抗炎和抗菌等多種藥理作用［3-5］。

蠶砂臨床應(yīng)用廣泛，在經(jīng)驗處方中，許多醫(yī)者常用蠶砂炒炭與其他藥物合用，用于治婦科疾?。?］。如《本草綱目》云“治消渴，癥結(jié)，及婦人血崩”，《儒門事親》載“婦人病證第七，治血崩，上為末”等。臨床實踐證明［7］，蠶砂炒炭后治療婦女血崩取得良效。除單味藥使用外，蠶砂炒炭與其他中藥如鹿角霜、杜仲、桂枝等配伍而成的蠶砂固經(jīng)湯，止血效果顯著。然而，蠶砂的這種炮制作用變化，目前文獻(xiàn)只是局限于處方配伍中的協(xié)同作用，雖然對化學(xué)成分和復(fù)方應(yīng)用研究較多［8-10］，但涉及蠶砂炒炭等炮制方面的研究較少?；诖耍狙芯拷柚F(xiàn)代研究手段和方法，開展蠶砂炒炭止血方面的研究，通過研究炒炭前后對小鼠出血時間和凝血時間的影響，來探討蠶砂止血作用機(jī)理，并為深入研究蠶砂提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 實驗動物 昆明種小鼠SPF級70只，體質(zhì)量（18±2）g，雄性，濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK（魯）2014－0007。

1.2 實驗試劑與儀器 蠶砂（代富安蟲草參茸行，批號：1892013），經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千鋒教授鑒定為蠶蛾科昆蟲家蠶（Bombyx moriL.）幼蟲的干燥糞便。0.9 %氯化鈉溶液（江西科倫藥業(yè)有限公司，批號C219011903-2）。 JY12001型電子天平（d=0.1 mg，上海衡平儀器儀表廠）；C21-RT2140型電磁爐（美的集團(tuán)）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋；帆船牌載玻片（25.4 mm×76.2 mm）；小鼠灌胃器、注射器、手術(shù)剪、濾紙等常規(guī)實驗室用品。

2 方法

2.1 供試品制備 生品制備：分別稱取蠶砂20.0 g、30.0 g、40.0 g，用紗布包好，置于燒杯中，加入10倍量的水，放置在95 ℃的水浴鍋中加熱30 min，過濾，往燒杯中加入8倍量的水，加熱20 min，合并兩次煎煮液，減壓過濾，在水浴鍋中加熱濃縮到40 mL，制備得蠶砂生品低、中、高各劑量的濃度，分別為0.5、0.75、1.0 g/mL。

炒炭品制備：稱取蠶砂210.0 g，用武火（160 ℃，1 000 W）分7次炒，每次30.0 g，炒至外表焦黑色，倒入鐵盤中平攤，放涼，得到蠶砂炒炭品137.4 g，得率65.4 %。依照生品供試品的制備方法，制備得炒炭品藥液，炒炭品低、中、高藥液濃度與生品相對應(yīng)。

2.2 動物分組與給藥 動物分組：昆明種SPF級雄性小鼠70只，體質(zhì)量（18±2）g，隨機(jī)分為7組，每組10只，分別為空白組，蠶砂生品低、中、高各劑量組，蠶砂炭品低、中、高各劑量組（低、中、高各劑量組濃度分別0.5、0.75、1.0 g/mL）。

給藥：各劑量組按照體質(zhì)量灌胃給藥，給藥量為0.4 mL/20 g，連續(xù)5 d，每天灌胃給藥1次?？瞻捉M給予等量的生理鹽水，在灌胃前用水浴鍋把藥液加熱到常溫。

2.3 小鼠出血時間測定 第5天給藥結(jié)束1 h后，在距離尾尖3 mm處剪去小鼠尾巴，有血液流出時開始計時，每隔10 s用濾紙輕輕拭血1次，直至拭后不再出血為止，所用時間為出血時間。

2.4 小鼠凝血時間測定 第5天給藥結(jié)束1 h后，用手術(shù)剪減去小鼠的睫毛和胡須，防止毛發(fā)中的蛋白質(zhì)融入血液中。將預(yù)先準(zhǔn)備好的毛細(xì)管，從小鼠右眼內(nèi)眥球后靜脈叢處插入，直至有血液泵出，并于此時開始計時，至血液充滿整個毛細(xì)管為止。抽出毛細(xì)管，取棉球擦拭小鼠眼部，按壓約30 s，防止血液外濺。將含有整管血液的玻璃毛細(xì)管平放于試驗臺上，每隔10 s于適當(dāng)位置折斷，并緩慢向左右兩側(cè)拉開，觀察折斷面是否有血凝絲，重復(fù)多次，直到有明顯的血凝絲出現(xiàn)為止，停止計時，所用時間即為凝血時間。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對小鼠出血時間的影響 與空白組對比，蠶砂炭品低、中、高各劑量組的出血時間明顯減少，組間差別具明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其中以高劑量組減少尤為明顯，其次為中劑量和低劑量組，說明蠶砂炒炭對小鼠出血時間的影響，與劑量存在關(guān)聯(lián)。蠶砂生品低、中、高各劑量組稍微升高，但差異不具統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。具體見表1。

表1 各組小鼠出血時間的比較（，n=10）

表1 各組小鼠出血時間的比較（，n=10）

注：與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 藥液質(zhì)量分?jǐn)?shù)/g .mL-1 出血時間/s空白組 - 455.41±17.38蠶砂生品低劑量組 0.5 459.63±26.60蠶砂生品中劑量組 0.75 463.60±18.54蠶砂生品高劑量組 1.0 459.45±28.89蠶砂炭品低劑量組 0.5 338.83±28.11**蠶砂炭品中劑量組 0.75 256.64±28.19**蠶砂炭品高劑量組 1.0 211.31±27.13**

3.2 對小鼠凝血時間的影響 與空白組對比，蠶砂炭品低、中、高各劑量組凝血時間明顯減少，組間差異均具明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），并隨著劑量的增大，凝血時間減少越明顯。蠶砂生品低劑量組凝血時間減少，但不具統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），生品中、高劑量組略有升高，但均不具統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），蠶砂炭品各劑量組與生品各劑量組的差別具明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），具體見表2。

表2 各小組凝血時間的比較（，n=10）

表2 各小組凝血時間的比較（，n=10）

注：與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 藥液質(zhì)量分?jǐn)?shù)/g .mL-1 凝血時間/s空白組 - 153.56±13.29蠶砂生品低劑量組 0.5 151.96±20.80蠶砂生品中劑量組 0.75 165.28±20.40蠶砂生品高劑量組 1.0 160.88±15.72蠶砂炭品低劑量組 0.5 112.85±12.56**蠶砂炭品中劑量組 0.75 105.20±12.95**蠶砂炭品高劑量組 1.0 64.39±13.42**

4 討論

資料表明，蠶砂炒炭品在復(fù)方應(yīng)用中具止血之效，常用于功能性子宮出血［11］，但這種作用是由于蠶砂單味藥作用，還是協(xié)同作用，仍缺乏現(xiàn)代研究基礎(chǔ)。且在現(xiàn)代應(yīng)用中多見于生品，炒炭品在中藥炮制法中并不常見。目前對中藥止血藥理作用研究，主要考察對受試動物出血時間和凝血時間的影響。由于出血時間與毛細(xì)血管、血小板的功能和數(shù)量、纖溶等因素有關(guān)，反映的是止血狀態(tài)；凝血時間主要與各種凝血因子的含量和功能有關(guān)［12-13］。

基于此，本文通過考察蠶砂炒炭前后對小鼠出血時間和凝血時間的影響，以研究其炒炭后的止血作用，以便為蠶砂在復(fù)方應(yīng)用提供理論依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，蠶砂生品對小鼠出血和凝血作用影響甚少，但炒炭后可明顯縮短小鼠的出血時間和凝血時間，其中蠶砂炭高劑量組對小鼠出血時間和凝血時間影響最大，說明蠶砂經(jīng)炒炭后具有明顯的止血功效。這對于從炮制角度來研究蠶砂的臨床應(yīng)用，意義重大。但這種作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究，希望本文能為深入研究蠶砂提供基礎(chǔ)。