補(bǔ)中益氣湯對荷MFC胃癌小鼠骨骼肌ATP生成、線粒體氧耗量及ATP合成酶表達(dá)的影響

★ 張雨璇 胡金鴻 陳謙峰（江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004）

胃癌作為消化系統(tǒng)中患病第一的癌癥,其病死率也位居前列［1］。近年來，胃癌的發(fā)病率居高不下，且出現(xiàn)年輕化趨勢。目前來說，手術(shù)切除是治療胃癌最主要的手段，且隨著腹腔鏡技術(shù)和內(nèi)鏡治療技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，胃癌的治愈率也得到一定程度的提高。但是它們的適用人群主要是胃癌早期患者，所以對于侵襲部位深、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、以及中晚期胃癌患者來說，目前主要還是依靠化學(xué)治療。癌因性疲乏（cancer-related fatigue，CRF）是腫瘤及其治療過程中最常見的并發(fā)癥之一，有研究表明大部分采取化療、放療的腫瘤患者，晚期均有過疲勞感［2］。CRF臨床表現(xiàn)主要為:非特異性疲勞、焦慮、悲傷感、睡眠障礙、情緒低落等癥狀，對患者的生活產(chǎn)生了負(fù)面影響。胃癌相關(guān)性疲勞是CRF中較為常見的一種，它與一般的疲勞不同在于，它的治療要立足于其腫瘤疾病本身。眾多研究表明有氧糖酵解是腫瘤代謝的主要方式，通過益氣健脾來提高細(xì)胞線粒體的氧化磷酸化，與癌細(xì)胞搶奪能源，抑制癌細(xì)胞進(jìn)行有氧糖酵解代謝，進(jìn)而起到讓癌細(xì)胞凋亡的目的［3］。因此，胃癌相關(guān)性疲勞與線粒體的氧化磷酸化密切相關(guān)，故提高患者的氧化磷酸化顯得至關(guān)重要。

補(bǔ)中益氣湯為脾胃派的經(jīng)典方，具有健脾益氣之功用，主治脾氣虛損之證。因營衛(wèi)氣血的化生有賴于脾胃的運(yùn)化，若脾胃氣虛，則會(huì)少氣乏力、面黃納呆、懶言倦??；脾在志為思，脾虛氣弱則思慮不決。中醫(yī)有研究表明，脾的功能與線粒體能量代謝有密切關(guān)系，而且補(bǔ)中益氣湯對線粒氧化磷酸化過程有一定的保護(hù)作用［4］。此外，一項(xiàng)小樣本量的臨床觀察發(fā)現(xiàn)“補(bǔ)中益氣丸對CRF有效”［5］。但尚未有關(guān)于補(bǔ)中益氣湯對胃癌CRF的影響及作用機(jī)制的研究。本文擬通過觀察補(bǔ)中益氣湯對荷MFC胃癌細(xì)胞模型動(dòng)物的骨骼肌ATP、ADP、AMP含量，及線粒體膜電位JC-1單體/聚合物、ATP合成酶蛋白的影響，研究補(bǔ)中益氣湯抗胃癌相關(guān)性疲勞的機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物 補(bǔ)中益氣湯購自江西省中醫(yī)院中藥房（黃芪15 g、黨參15 g、白術(shù)10 g、當(dāng)歸10 g、陳皮6 g、柴胡12 g、升麻 6 g、炙甘草15 g、生姜 9 g、大棗18 g）；制備采取常用中藥煎劑方法，首先純凈水洗凈，至少兩遍，并浸泡30 min，初次煎煮1 h，過濾，得到上層澄清濾液；再加水煎煮1 h左右，過濾，將兩次濾液混合濃縮得到所需濃度溶液，4 ℃分裝保存，用時(shí)水浴加熱至常溫。本實(shí)驗(yàn)所需補(bǔ)中益氣湯濃度分為高、中、低三種，根據(jù)人和動(dòng)物之間的劑量換算，可得低濃度為0.437 5 g/mL、中濃度為0.875 g/mL、高濃度為1.75 g/mL。注射用環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX），江西恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)H32020857）。

1.2 動(dòng)物和瘤株 小鼠：60只SPF級(jí)KM雄性小鼠，體重（20±2）g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0010。小鼠胃癌MFC細(xì)胞來源：由中科院細(xì)胞庫提供（編號(hào)CBP60882）。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：JZLLSC2018-0061。

1.3 試劑 ATP、ADP、AMP標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司，貨號(hào)分別為A2383、A2754、A1752）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)AR0146）；組織線粒體分離試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為C3606，C2006）；RIPA裂解液（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號(hào)B1828）；PVDF轉(zhuǎn)印膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Millipore公司，貨號(hào)分別為IPVH00010、WBKLS0100）；X光膠片（美國柯達(dá)公司，貨號(hào)6535876）。

1.4 儀器 高效液相色譜儀（美國Waters公司）；色譜柱（美國phenomenex公司）；TDK-2水平脫色搖床（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；S-1-150S臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司）；智能型電泳儀（南京普陽科學(xué)儀器研究所），垂直電泳槽（美國賽默飛公司）；DYCZ-40D型迷你轉(zhuǎn)印電泳槽（北京六一儀器廠）；NovoCyte型流式細(xì)胞儀（美國ACEA公司）。

2 方法

2.1 小鼠MFC胃癌細(xì)胞培養(yǎng)及傳代方法 將腹水型小鼠胃癌MFC細(xì)胞，置5 % CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，用含10 % FCS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。選取活力最優(yōu)的小鼠MFC胃癌細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×106/mL，以0.2 mL/只無菌注入KM小鼠腹腔，進(jìn)行體內(nèi)傳代，待小鼠腹部隆起并有腹水，便可用于小鼠皮下移植瘤的接種［6］。

2.2 小鼠荷MFC胃癌模型制作方法 將接種胃癌MFC瘤種7~9 d的小鼠脫頸處死，在無菌環(huán)境下抽取瘤液腹水，經(jīng)生理鹽水稀釋、1500轉(zhuǎn)離心5分鐘后，調(diào)整MFC細(xì)胞濃度為5×106/ml，在小鼠右側(cè)腋部皮下注射，接種量為1×106個(gè)細(xì)胞/只（2 mL）。接種后第三天可在小鼠右腋下接種處觸及腫瘤硬塊，成瘤率100 %。

2.3 分組與給藥 將小鼠隨機(jī)分成5組，分別為模型組，補(bǔ)中益氣湯高劑量組、中劑量組、低劑量組，陽性對照組，每組12只。接種24 h后，補(bǔ)中益氣湯低劑量組（0.045 g·kg-1·d-1）、中劑量組（0.09 g·kg-1·d-1）、高劑量組（0.18 g·kg-1·d-1）灌胃給藥，每只0.5 mL，每日2次；陽性對照組使用環(huán)磷酰胺（0.05 g·kg-1·d-1）隔日腹腔注射；模型組給傳代腫瘤小鼠予等體積生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥2周，治療結(jié)束，處死各組小鼠。

2.4 HPLC檢測骨骼肌ATP、ADP及AMP含量色譜條件為流動(dòng)相30 mM NaH2PO4（pH=6.25），3 % 甲醇；檢測波長254 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫為室溫，樣品溫度4 ℃。配置不同濃度的ATP、ADP、AMP溶液，測定后以峰面積為Y軸，濃度為X軸進(jìn)行線性擬合，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。組織稱重、粉碎、勻漿；10 000×g 4℃離心10 min，取上清液100 μL，加入1 mol/L 碳酸鉀-甲醇混合液（體積比4∶1）中和高氯酸50 μL，10 000×g 4℃離心10 min，取上清100 μL加水100 μL稀釋，HPLC檢測。

2.5 檢測骨骼肌線粒體的膜電位JC-1單體/聚合物 剖取各組小鼠的骨骼肌冰上保存，使用組織線粒體分離試劑盒進(jìn)行線粒體分離，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行樣品蛋白濃度測算，使用線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）結(jié)合流式細(xì)胞儀分析單體/聚合物數(shù)值（其中JC-1單體激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為530 nm；JC-1聚合物激發(fā)波長為525 nm，發(fā)射波長為590 nm）。

2.6 Western blot檢測ATP合成酶蛋白的表達(dá) 取小鼠骨骼肌（腓腸?。┙M織，進(jìn)行蛋白免疫印跡（western blot）檢測。依次配置溶液、制備樣品、SDS-PAGE凝膠電泳、化學(xué)發(fā)光、顯影、定影后，通過蛋白質(zhì)印跡檢測圖像分析蛋白條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白ATP6V1G2/tubulin灰度值反映ATP合成酶蛋白表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以（P＜0.05）表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)中益氣湯對荷MFC小鼠骨骼肌ATP、ADP、AMP含量的影響 與模型組比較，中劑量組的ATP及ADP含量顯著升高（P＜0.01），陽性對照組、高劑量組、低劑量組的ATP及ADP含量升高（P＜0.05）；與陽性對照組比較，中劑量組的ATP及ADP含量顯著升高（P＜0.01）,高劑量組、低劑量組的ATP及ADP含量升高（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組、低劑量組的ATP及ADP含量降低（P＜0.05）。

與模型組比較，中劑量組的AMP含量顯著降低（P＜0.01），陽性對照組、高劑量組、低劑量組的ATP及ADP含量降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，中劑量組的AMP含量顯著降低（P＜0.01）,高劑量組、低劑量組的ATP及ADP含量降低（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組、低劑量組的AMP含量升高（P＜0.05）。見表1。

表1 補(bǔ)中益氣湯對荷MFC小鼠骨骼肌ATP、ADP、AMP含量的影響（，ng/mg）

表1 補(bǔ)中益氣湯對荷MFC小鼠骨骼肌ATP、ADP、AMP含量的影響（，ng/mg）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 n ATP ADP AMP模型組 9 601.393±58.411 271.457±41.182 157.080±14.684陽性對照組 10 651.973±52.945* 285.680±78.669* 147.003±18.016*中劑量組 10 906.183±83.386**## 356.013±43.533**## 127.407±7.899**##高劑量組 10 878.507±75.288*#▲ 312.467±52.717*#▲ 136.387±21.654*#▲低劑量組 10 735.523±68.344*#▲ 291.793±45.766*#▲ 146.747±4.686*#▲

3.2 補(bǔ)中益氣湯對荷MFC胃癌小鼠骨骼肌線粒體膜電位JC-1單體/聚合物的影響 線粒體膜電位JC-1單體/聚合物%的比值越小，說明線粒體膜電位越大。與模型組比較，陽性對照組、中劑量組、高劑量組、低劑量組的單體/聚合物%顯著降低（P＜0.01）；與陽性對照組比較，中劑量組的單體/聚合物%顯著降低（P＜0.01）,高劑量組、低劑量組的單體/聚合物%降低（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組、低劑量組的單體/聚合物%升高（P＜0.05）。見表2。

表2 補(bǔ)中益氣湯對荷MFC胃癌小鼠骨骼肌線粒體膜電位JC-1單體/聚合物的影響（，%）

表2 補(bǔ)中益氣湯對荷MFC胃癌小鼠骨骼肌線粒體膜電位JC-1單體/聚合物的影響（，%）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 n JC-1單體 JC-1聚合物 JC-1單體/聚合物模型組 9 4.223±0.412 93.162±9.391 4.743±0.401陽性對照組 10 2.302±0.243 95.563±8.972 2.407±0.262**中劑量組 10 0.415±0.043 99.240±10.181 0.413±0.038**##高劑量組 10 1.513±0.061 98.852±9.673 1.516±0.061**#▲低劑量組 10 1.580±0.032 98.641±8.950 1.588±0.020**#▲

3.3 補(bǔ)中益氣湯對荷MFC胃癌小鼠骨骼肌線粒體ATP合成酶表達(dá)的影響 與模型組比較，中劑量組的ATP合成酶蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），陽性對照組、高劑量組、低劑量組的ATP合成酶蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與陽性對照組比較，中劑量組的ATP合成酶蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）,高劑量組、低劑量組的ATP合成酶蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組、低劑量組的ATP合成酶蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

表3 補(bǔ)中益氣湯對荷MFC胃癌小鼠骨骼肌線粒體ATP合成酶表達(dá)的影響（，OD）

表3 補(bǔ)中益氣湯對荷MFC胃癌小鼠骨骼肌線粒體ATP合成酶表達(dá)的影響（，OD）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 n ATP6V1G2 tubulin ATP6V1G2/tubulin模型組 9 4.609±0.038 10.502±0.121 0.439±0.056陽性對照組 10 5.644±0.076 11.542±0.136 0.516±0.059*中劑量組 10 9.701±0.084 10.694±0.125 0.946±0.089**##高劑量組 10 7.151±0.093 9.845±0.102 0.722±0.093*#▲低劑量組 10 5.866±0.078 10.625±0.118 0.563±0.075*#▲

4 討論

胃癌是我國常見的消化系統(tǒng)癌癥，其并發(fā)癥——胃癌相關(guān)性疲勞，是影響患者的生活質(zhì)量的重要原因之一。有研究總結(jié)脾胃虧損是胃癌所有病機(jī)共同擁有的主線［7］。補(bǔ)中益氣湯是“脾胃學(xué)說”創(chuàng)始人李杲的代表方，主治脾虛氣陷，氣虛發(fā)熱。據(jù)文獻(xiàn)和研究表明，有氧糖酵解是腫瘤代謝的主要方式。由能量驅(qū)動(dòng)的骨骼肌運(yùn)動(dòng)是機(jī)體活動(dòng)的主要方面，體內(nèi)ATP是能量物質(zhì)的主要存在形式，而ATP主要是在機(jī)體的“能量加工廠”——線粒體的氧化磷酸化生成。作為必不可少的催化劑——ATP合成酶，是細(xì)胞膜上的一種蛋白酶，機(jī)體在缺氧及疲勞等狀態(tài)下，ATP合成酶受到損傷，活力下降［8］。因此，ATP、ADP和AMP的含量與胃癌CRF密切相關(guān)，骨骼肌中線粒體含量和ATP合成酶表達(dá)均能反映機(jī)體是否疲勞及疲乏程度。目前提出的CRF病因機(jī)制假說中“肌肉的改變和ATP代謝異常”較為大家認(rèn)可［9］。

本文在對骨骼肌ATP生成的影響實(shí)驗(yàn)和骨骼肌線粒體氧耗量影響實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)中益氣湯中劑量組的ATP、ADP含量明顯增加，線粒體膜電位沒有很大的變動(dòng)、ATP儲(chǔ)存量良好、耗氧量無明顯減少。線粒體的膜電位可以體現(xiàn)它的功能，若線粒體膜電位穩(wěn)定則說明細(xì)胞狀態(tài)良好，而線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡的早期現(xiàn)象，導(dǎo)致ATP生成不足，則線粒體耗氧量下降。胃癌相關(guān)性疲勞會(huì)導(dǎo)致線粒體形態(tài)改變、ATP代謝異常、細(xì)胞內(nèi)ATP匱乏以及ATP數(shù)量減少的癥狀，會(huì)導(dǎo)致線粒體耗氧量下降。補(bǔ)中益氣湯可通過“健脾”對骨骼肌線粒體氧化磷酸化過程有一定的保護(hù)作用，并通過保護(hù)骨骼肌的氧化磷酸化使得胃癌CRF得以緩解。補(bǔ)中益氣湯保護(hù)骨骼肌的氧化磷酸化作用機(jī)理是使ADP和AMP可以更高效率轉(zhuǎn)化為ATP，減少氧化磷酸化過程，為機(jī)體代謝和生命活動(dòng)的維持，提供更好的條件，以降低疲勞感。

補(bǔ)中益氣湯對線粒體ATP合成酶表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知：補(bǔ)中益氣湯能夠有效地促進(jìn)線粒體ATP合成酶的活性，從而增強(qiáng)小鼠的活動(dòng)性，達(dá)到治療腫瘤相關(guān)性疲勞的作用。正常情況下，電子傳遞鏈和磷酸化緊密結(jié)合，當(dāng)有其他物質(zhì)干擾磷酸化反應(yīng)時(shí)則氧化磷酸化不能正常進(jìn)行，癌細(xì)胞與小鼠機(jī)體正常細(xì)胞爭奪能量，導(dǎo)致氧化磷酸化不能正常進(jìn)行，即出現(xiàn)胃癌疲勞。補(bǔ)中益氣湯能夠有效的抑制癌細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞奪取能量的能力，從而達(dá)到緩解CRF的效果。這表明補(bǔ)中益氣湯可通過“益氣”對骨骼肌線粒體能量儲(chǔ)備有一定的促進(jìn)作用，有增強(qiáng)機(jī)體機(jī)能、恢復(fù)機(jī)體體力、改善疲勞狀態(tài)、固元培本的效能。

本文研究補(bǔ)中益氣湯抗胃癌相關(guān)性疲勞的機(jī)制，引入現(xiàn)代生命科學(xué)研究成果，特色地將“健脾”與“保護(hù)骨骼肌氧化磷酸化”相聯(lián)系，“益氣”與“增強(qiáng)線粒體能量儲(chǔ)備”相聯(lián)系，賦予補(bǔ)中益氣湯“健脾”及“益氣”功效以具體指向，極富中西醫(yī)結(jié)合特色。中醫(yī)補(bǔ)中益氣湯“健脾益氣”治法理論指導(dǎo)治療癌性疲勞研究，揭示該方抗胃癌CRF“健脾益氣”治法的科學(xué)內(nèi)涵，既有中醫(yī)理論指導(dǎo)，又有現(xiàn)代研究內(nèi)容，拓展了CRF治療新思路。