5-甲基間苯二酚對銅綠假單胞菌及其生物膜形成的影響

朱 娟， 付菊花， 佘鵬飛， 伍 勇*

(1.中南大學(xué) 湘雅三醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 長沙 410013；2.中南大學(xué) 湘雅三醫(yī)院人力資源部，湖南 長沙 410013)

細(xì)菌生物膜(biofilm, BF)是細(xì)菌及其分泌的胞外基質(zhì)等物質(zhì)所形成的膜狀聚合物，其胞外基質(zhì)主要由細(xì)菌分泌的細(xì)胞外多糖、胞外DNA、脂類和蛋白質(zhì)等組成[1]。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaureginosa)是一種院內(nèi)感染常見的條件性致病革蘭陰性桿菌，易在醫(yī)療器械和人體組織表面形成BF[2]。P.aureginosaBF的形成主要分三步：①初始黏附期：細(xì)菌通過鞭毛的介導(dǎo)作用，游向介質(zhì)表面，并通過菌毛等表面黏附因子黏附在宿主表面，此階段的BF易受到外界物質(zhì)的破壞；②BF形成期和成熟期：此階段的細(xì)菌分泌大量胞外多糖, 從而加固BF厚度及硬度, 對外部侵入具有更強(qiáng)的保護(hù)作用，此階段的BF所包裹的菌團(tuán)內(nèi)部可形成一個(gè)親水性的孔道, 可給BF輸送各種營養(yǎng)物質(zhì)及排出各種代謝產(chǎn)物；③BF分散期：BF成熟一定時(shí)間后, 部分細(xì)菌會從BF中游離出來，參與到下一個(gè)BF形成的循環(huán)過程中[3-4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，感染相關(guān)性疾病中BF的形成率超過75%。BF的存在大大提高了微生物的耐藥性，其耐藥性是浮游細(xì)菌的10～1 000倍[5]。BF的形成具有屏障作用，能限制抗菌藥物分子滲透進(jìn)入膜內(nèi)與膜內(nèi)細(xì)菌作用, 從而導(dǎo)致抗菌藥物只能殺滅表層細(xì)菌，而無法對深部細(xì)菌發(fā)揮作用。此外，帶負(fù)電荷的胞外脂多糖可與抗菌藥物分子結(jié)合, 并顯著降低進(jìn)入BF內(nèi)的藥物濃度，也使得抗菌藥物對BF內(nèi)細(xì)菌的作用顯著降低。一旦形成BF，就很難用常規(guī)的抗生素根除[6]。因此，開發(fā)新的抗菌劑對抗BF的形成是當(dāng)務(wù)之急。5-甲基間苯二酚是常見的革蘭陰性桿菌代謝產(chǎn)物[7]，然而外源性的5-甲基間苯二酚對細(xì)菌的影響還尚未研究。因此，本研究通過建立體外P.aureginosaBF模型，探討5-甲基間苯二酚的抗菌活性并進(jìn)一步研究其對P.aureginosaBF的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 銅綠假單胞菌(P.aureginosa)標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)AO1由南開大學(xué)喬明強(qiáng)惠贈。銅綠假單胞菌臨床菌株于2014年1月至12月分離自中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院檢驗(yàn)科痰液標(biāo)本。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB肉湯(上海索萊寶公司)；MH肉湯(美國Oxoid公司)。

1.1.3 主要試劑與儀器 96孔板(美國Corning/Costar公司)；5-甲基間苯二酚(上海源葉生物有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(YXQ602，美國ThermoFish公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；麥?zhǔn)媳葷醿x(法國梅里埃公司)；恒溫?fù)u床(ZWY-100H，美國ThermoFish公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 挑取培養(yǎng)過夜的單個(gè)菌落于MH肉湯中，用麥?zhǔn)媳葷醿x控制菌液濁度0.5 McF，稀釋100倍后，于96孔板中每孔加入50 μL，再將5-甲基間苯二酚用MH肉湯倍比稀釋后分別加入每孔，于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃靜置孵育16～18 h后判讀結(jié)果。最低抑菌濃度即為開始出現(xiàn)肉眼不可見濁度的最低藥物濃度[8]。

1.2.2 時(shí)間-生長曲線 用LB肉湯將5-甲基間苯二酚稀釋至工作質(zhì)量濃度(0～1 500 μg/mL)備用。挑取培養(yǎng)過夜的單個(gè)菌落于LB肉湯中37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)過夜，用已稀釋的5-甲基間苯二酚將細(xì)菌稀釋至約106cfu/mL，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，分別于4、8、16 h時(shí)吸取200 μL至96孔板，酶標(biāo)儀檢測630 nm處的吸光度，即為細(xì)菌濁度[9]。

1.2.3 5-甲基間苯二酚對P.aureginosaBF形成的影響 挑取培養(yǎng)過夜的單個(gè)菌落于LB肉湯中，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，用LB肉湯稀釋細(xì)菌至約2×106cfu/mL，再分別加50 μL至96孔板中。將5-甲基間苯二酚用LB肉湯倍比稀釋后，分別加50 μL至已加菌液的孔中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，用1×PBS洗去未與孔壁結(jié)合的浮游細(xì)菌，每孔再分別加入100 μL 0.25%的結(jié)晶紫染液，靜置染色15 min后，棄去結(jié)晶紫染液，并用1×PBS洗去未結(jié)合的結(jié)晶紫，于室溫晾干后，每孔分別加入100 μL 95%乙醇溶液溶解結(jié)晶紫，靜置孵育20 min后，用酶標(biāo)儀檢測570 nm處吸光度，即為生物膜的相對量[10]。

1.2.4 5-甲基間苯二酚分散P.aureginosa已形成的BF 挑取培養(yǎng)過夜的單個(gè)菌落于LB肉湯中培養(yǎng)24 h后，用LB肉湯稀釋至約2×106cfu/mL，分別加200 μL至96孔板中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，用1×PBS洗去未與孔壁結(jié)合的浮游細(xì)菌，每孔再分別加入200 μL倍比稀釋的5-甲基間苯二酚。靜置孵育24 h后，用1×PBS洗去未與孔壁結(jié)合的浮游細(xì)菌，結(jié)晶紫染色，方法同1.2.3[10]。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過Excel和GraphPad7.0完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本之間的比較，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 5-甲基間苯二酚對P.aureginosa浮游細(xì)菌的影響

與對照組相比較，當(dāng)5-甲基間苯二酚的質(zhì)量濃度≤100 μg/mL時(shí)，對P.aureginosa浮游細(xì)菌的增殖無影響。而當(dāng)其質(zhì)量濃度≥250 μg/mL時(shí)，可顯著抑制P.aureginosa浮游細(xì)菌的增殖，隨著5-甲基間苯二酚的濃度增高，其抑制能力增強(qiáng)。浮游細(xì)菌的增殖對5-甲基間苯二酚濃度具有顯著的劑量依賴性，見圖1。

圖1 5-甲基間苯二酚對P.aureginosa PAO1浮游細(xì)菌增殖的影響Fig.1 Effects of 5-methylresorcinol on planktonic cell growth of P. aureginosa PAO1

2.2 5-甲基間苯二酚對P.aureginosa BF 形成的影響

當(dāng)5-甲基間苯二酚的質(zhì)量濃度為512 μg/mL時(shí)，可顯著抑制PAO1生物膜的形成，使其生物膜的形成量從(1.082±0.059)減少到(0.782±0.062)(t=6.071 0,P=0.003 7)，當(dāng)5-甲基間苯二酚的質(zhì)量濃度增加到1 024 μg/mL時(shí)，生物膜的形成量減少到(0.093±0.037)(t=24.600,P<0.000 1)。然而，不同菌株對5-甲基間苯二酚的敏感性不同，5-甲基間苯二酚對銅綠假單胞菌臨床菌株P(guān)A47生物膜的形成無影響，見圖2A；同時(shí)，32 μg/mL的5-甲基間苯二酚還能顯著分散PAO1成熟生物膜，使其生物膜從(2.010±0.130)減少到(1.352±0.071)(t=7.694 0,P=0.001 5)。且由圖1可知，5-甲基間苯二酚的質(zhì)量濃度≤100 μg/mL時(shí)，對P.aureginosa浮游細(xì)菌的增殖無影響。因此，5-甲基間苯二酚對PAO1的生物膜的抑制作用不僅歸因于其殺菌作用，還存在其他機(jī)制。而當(dāng)5-甲基間苯二酚的質(zhì)量濃度≥128 μg/mL時(shí)，可顯著分散PA47生物膜，使其BF從(3.025±0.098)減少到(2.423±0.273)(t=3.595 0,P=0.022 9)。但隨著5-甲基間苯二酚的濃度增加，無顯著的劑量依賴性，見圖2B。

圖2 5-甲基間苯二酚對P.aureginosa BF的影響Fig.2 Effects of 5-methylresorcinol on the biofilms of P.aureginosa A：5-甲基間苯二酚對P.aureginosa BF的抑制作用,*表示與對照組相比，5-甲基間苯二酚對PAO1生物膜的抑制有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；B：5-甲基間苯二酚對P.aureginosa BF的分散作用，#表示與對照組相比，5-甲基間苯二酚對PAO1生物膜的分散有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，*表示與對照組相比，5-甲基間苯二酚對PA47生物膜的分散有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 A： Biofilm inhibitory effects of 5-methylresorcinol against P.aureginosa，* indicates that 5-methylresorcinol has a statistically significant difference in inhibition of PAO1 biofilm compared with the control group；B： Biofilm eradication effects of 5-methylresorcinol against P.aureginosa，# indicates that 5-methylresorcinol has a statistically significant difference in the eradication of PAO1 biofilm compared with the control group, * indicates that 5-methylresorcinol has a statistically significant difference in the eradication of PA47 biofilm compared with the control group

2.3 5-甲基間苯二酚對P.aureginosa臨床菌株BF形成的影響

不同P.aureginosa臨床菌株對5-甲基間苯二酚的敏感性各異。512 μg/mL的5-甲基間苯二酚可顯著抑制PA1434和PA1430生物膜的形成；1 024 μg/mL的5-甲基間苯二酚可顯著抑制PA1401、PA1409、PA1434、PA1435、PA1439、PA1447和PA1430生物膜的形成。而5-甲基間苯二酚對PA1429和PA1440生物膜形成無影響，見圖3。

圖3 5-甲基間苯二酚對P.aureginosa 臨床菌株BF的抑制作用Fig.3 Biofilm inhibitory effects of 5-methylresorcinol against clinical isolates of P.aureginosa

3 討 論

生物膜相關(guān)疾病已成為臨床診療中的棘手難題。傳統(tǒng)抗生素常難以根除人體內(nèi)已形成的生物膜。新藥的開發(fā)利用已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，而5-甲基間苯二酚對P.aureginosa的影響尚未見研究。本研究發(fā)現(xiàn)，5-甲基間苯二酚能有效抑制P.aureginosa的增殖，且亞抑菌濃度的5-甲基間苯二酚能抑制其生物膜的形成。

本研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌不同臨床菌株的生物膜對5-甲基間苯二酚的敏感性不同。一方面，不同細(xì)菌的細(xì)胞壁組分不同，當(dāng)細(xì)胞壁較厚或者外排泵表達(dá)增高時(shí)，可能導(dǎo)致5-甲基間苯二酚無法充分進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[11]；另一方面，不同菌株群體密度感應(yīng)(quorum sensing, QS)系統(tǒng)各組分的表達(dá)存在異質(zhì)性(P.aureginosa生物膜的形成周期主要受QS系統(tǒng)調(diào)控)[12-13]，QS系統(tǒng)相關(guān)受體表達(dá)量的改變可影響5-甲基間苯二酚的作用效果。

單獨(dú)使用抗菌藥物往往難以徹底根除生物膜，隨著劑量的增加，藥物的毒副作用也隨之增強(qiáng)[14]。因此，5-甲基間苯二酚與其他P.aureginosa相對敏感抗生素聯(lián)合應(yīng)用，以期增加藥物協(xié)同作用，降低藥物的毒性，這將成為研究的重點(diǎn)。

P.aureginosa生物膜狀態(tài)下的耐藥性極大增加，常規(guī)用藥難以有效清除體內(nèi)的生物膜。亞抑菌濃度的5-甲基間苯二酚能有效抑制P.aureginosa生物膜的形成，有望成為治療P.aureginosa相關(guān)生物膜病的有效手段。