光照處理對冬蟲夏草單孢菌株生長代謝的影響

謝 放，蘇強軍，夏櫻霞，李佳瑩，陳照禾，周 剛

(蘭州交通大學 生物與制藥工程學院,蘭州 730070)

光照是生物體重要的能源和信息源。對真菌而言，光照主要作為信息源而非能源。多年來在真菌的研究中，有上百種的真菌都發(fā)現(xiàn)了光反應機制的存在[1]。光的作用機制是復雜的，對不同真菌而言，不同的光質(zhì)與波長對其影響作用不同，既可以促進真菌的發(fā)育，也可抑制真菌的發(fā)育[2]。

在高等絲狀真菌以及蟲草屬真菌的報道中，已經(jīng)證明感光基因在真菌中的存在，并與其生長代謝有密切關系[3-4]。在對蛹蟲草的研究中發(fā)現(xiàn)，藍光照射下蛹蟲草原基分化更快更多，對蛹蟲草子實體產(chǎn)量沒有明顯的促進和抑制作用[5]。敲除Cmwc-1基因的蛹蟲草均不能形成原基和子實體，光照后不轉色，分生孢子、類胡蘿卜素和蟲草素產(chǎn)量較野生型低，表明光受體Cmwc-1調(diào)控蛹蟲草的生長發(fā)育和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[6-7]。適當?shù)乃{光光照有助于柞蠶蛹蟲草子座的生長，光照度為308.37lx，光照時長為10.6h/d時，最利于胡蘿卜素的合成，光照度和光照時間的變化對蛹蟲草子座的生長均有一定的影響[8]。

冬蟲夏草是由冬蟲夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲而形成的蟲草復合體，僅分布于青藏高原及周邊高海拔地區(qū)。其可分為有性階段和無性階段兩種形態(tài)，學術界普遍認為冬蟲夏草的無性型為中國被毛孢(Ophiocordycepssinensis)[9]，這一結論普遍得到了分子生物學證據(jù)的支持[10]。冬蟲夏草菌歸屬于子囊菌門(Ascomycota)糞殼菌綱(Sordariomycetes)肉座菌目(Hypocreales)線形蟲草屬(Ophiocordyceps)[11]。近年來，由于野生有性型被無限制地采挖，致使野生有性型數(shù)量銳減[12]。因此，通過培育冬蟲夏草無性型獲得菌絲體作為天然冬蟲夏草的替代品顯得尤為重要。對于溫度、pH、碳氮源、無機鹽等條件對中國被毛孢生長發(fā)育的影響較為清楚，文獻報道相對較多，但對于光照與中國被毛孢生長發(fā)育之間的關系鮮有報道。目前只知道在中國被毛孢有性階段子囊孢子的彈射需要一定的紫外照射[13]，而對于無性階段，光照對其有何影響，并無相關研究。

多年來冬蟲夏草的研究結果在不同的報道中出現(xiàn)相互矛盾的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)極有可能與研究中所使用的真菌材料存在較大的差異有關[14]。一直以來對于冬蟲夏草是否為多菌種復合體有很大爭議[15]，對其宏基因組研究發(fā)現(xiàn)，不同樣品中真菌和細菌組成分布是有所不同的[16]。這使得選擇高純度的菌種材料成為研究冬蟲夏草的重要一環(huán)。

以往的研究材料基本上采用組織分離所得到的菌株，鑒于冬蟲夏草的無性型為中國被毛孢仍有一些不同看法，為嚴謹起見，本研究采用冬蟲夏草子囊孢子分離得到的單子囊孢子菌株作為研究材料。在經(jīng)過光照處理后觀察、檢測其菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、分生孢子量、甘露醇、多糖、尿素、多酚及腺苷的含量與黑暗條件進行對比，初步了解光照處理對中國被毛孢的影響，旨在探明光照因素對中國被毛孢菌絲體生長代謝的影響規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種 子囊孢子于2019年采自甘肅省武威市天?？h代乾牧場的冬蟲夏草，獲得的單子囊孢子菌株命名為TZ8-1(現(xiàn)保存于蘭州交通大學化學與生物工程學院生物種苗研究所)。

1.1.2 培養(yǎng)基 (1)牛奶培養(yǎng)基：每1 L培養(yǎng)基中包含土豆200 g，牛奶200 mL，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水解乳蛋白5 g，酵母粉1 g，硫酸鎂0.2 g，磷酸二氫鉀1 g，復合維生素B 1片，蒸餾水 1 000 mL。

(2)水瓊脂培養(yǎng)基：每1 L培養(yǎng)基含瓊脂10 g，蒸餾水1 000 mL。

(3)1/2 PPDA培養(yǎng)基：每1 L培養(yǎng)基含土豆100 g，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，瓊脂7.5 g，鏈霉素0.1 g，四環(huán)素0.05 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試驗儀器 光照培養(yǎng)箱(LRH-250-G)，低溫培養(yǎng)箱(LRH-200CL)，紫外-可見光分光光度計(U759),超高效液相色譜儀(Waters Acquity UPLC I-Class，沃特世，美國),精度電子天平(JJ500),高壓蒸汽滅菌鍋(BXM-30R),恒溫數(shù)碼顯示水浴鍋(HH-2),超聲波清洗器(KQ-250DE)。

1.1.4 試劑 甲醇(色譜純)、腺苷標準品(中國藥品生物制品鑒定所)及其他藥品(無特殊說明均為分析純)。

1.2 方 法

1.2.1 單孢菌株的分離 首先用無菌的玻璃紙?zhí)资占x夏草子囊孢子，將收集的子囊孢子用無菌水沖洗脫落，置于18 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)萌發(fā)5 d，待子囊孢子萌發(fā)后取200 μL均勻的浸涂在事先準備好的水瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，待培養(yǎng)基表面無液體時，將水瓊脂平板移至于光學顯微鏡下找到單個已經(jīng)萌發(fā)的子囊孢子將其挑出，接種于提前準備好的1/2 PPDA培養(yǎng)基中，再將接種有單子囊孢子的1/2 PPDA平板放置于18 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，待其生長60 d后便可得到由單個冬蟲夏草子囊孢子發(fā)育而來的菌株[17]。

1.2.2 單孢菌株的驗證 由于中國被毛孢菌絲體致密，用普通的真菌基因組DNA抽提試劑盒難以提取到基因組DNA，故選用動物基因組DNA抽提試劑盒提取單孢菌株的基因組DNA，PCR擴增ITS序列并由華大基因測序，用MEGA-X軟件構建NG系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 光照處理 將中國被毛孢單孢菌株轉接至牛奶培養(yǎng)基中，置于18 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，包裹4層報紙和1層錫箔紙來隔絕散射光，黑暗培養(yǎng)30 d后，取出一半置于18 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，光照度約為300 lx，光質(zhì)為LED全光譜的植物生長調(diào)節(jié)光，培養(yǎng)30 d。另一半繼續(xù)置于黑暗條件下18 ℃恒溫培養(yǎng)30 d。

1.2.4 菌落與菌絲形態(tài)的觀察 觀察光照與黑暗條件下中國被毛孢菌落形態(tài)、大小、顏色、色素沉積程度。用透明膠帶輕粘菌絲，再將粘有菌絲的透明膠帶固定至載玻片上，放置到光學顯微鏡下400倍觀察并記錄光照與黑暗條件下中國被毛孢菌絲形態(tài)有何差異。將同一顯微鏡視野以九宮格分開，選取四角與最中心的5個格，挑取每格中最清晰完整的兩根菌絲，測量菌絲兩拐點間的長度，記錄并求平均值，每組試驗設3個平行。

1.2.5 分生孢子數(shù)量的統(tǒng)計 加入5 mL無菌水于菌落平板內(nèi)，用毛筆輕輕刷洗菌落表面，將分生孢子從菌落表面洗下，再用無菌水潤洗過的4層紗布將菌絲、培養(yǎng)基等雜質(zhì)過濾掉，最后定容到10 mL。將得到的分生孢子液每次取10 μL于光學顯微鏡下計數(shù)，重復10次，計算得到100 μL分生孢子液的濃度，進一步計算得到10 mL分生孢子液中分生孢子的數(shù)量，每組試驗設3個平行。

1.2.6 菌落鮮質(zhì)量與干質(zhì)量的測量 將整個菌落連帶培養(yǎng)基一起取下，用熱水洗去培養(yǎng)基得到干凈完整的菌落，再用吹風機吹干菌落表面水分，之后用電子天平秤量菌落鮮質(zhì)量。再將菌落置于55 ℃干燥烘箱中，期間每20 min秤量一次，直至質(zhì)量不再變化為止，以最后一次秤量結果記為菌落干質(zhì)量，每組試驗設3個平行。

1.2.7 甘露醇、多糖、尿素和多酚含量的測定 甘露醇含量的測定采用高碘酸鈉比色法[18]，多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[19]，尿素含量的測定采用PDAB法[20]，多酚含量的測定采用Folin-酚法[21-22]，每組試驗設3個平行?；貧w方程如表1所示，4個回歸方程均是將標準品配置成6個濃度梯度所測得，相關系數(shù)均大于0.99，這說明試驗所得標準曲線線性關系良好，均能為下一步試驗所用。

表1 4種代謝物的回歸方程Table 1 Regression equations of four metabolites

1.2.8 用超高效液相色譜法測量腺苷的含量 樣品的前處理：秤取菌絲體粉末0.05 g加入2 mL超純水,超聲波100 W、60 ℃處理90 min, 12 000 r/min離心10 min，取上清,重復提取3次，上清合并過0.22 μm濾膜后進行超高效液相色譜檢測[23]。

對照溶液的配置：精密秤取腺苷對照品1.26 mg，用超純水溶解稀釋并定容至5 mL容量瓶中，制成腺苷質(zhì)量濃度為252 mg/L的對照品儲備液，再用超純水分別稀釋2、4、8、16、32倍得到腺苷質(zhì)量濃度分別為126、63、31.5、15.75、7.875 mg/L的標準工作溶液，置于4 ℃冰箱冷藏，備用[24-25]。

色譜條件：色譜柱為 Waters ACQUITY YPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，流速為0.25 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，流動相為0.3%甲酸水溶液與甲醇,梯度洗脫程序見表2[26]。

表2 UPLC梯度洗脫程序Table 2 UPLC gradient elution procedure

標準曲線與回歸方程：如圖1所示，以腺苷峰面積(yi)與對應的腺苷質(zhì)量濃度(xi,mg/L)作曲線，經(jīng)計算其回歸方程為y=58 421x+ 1 919 970(R2=0.996)，表明腺苷標準品質(zhì)量濃度在7.875～252 mg/L范圍內(nèi)線性關系良好。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0進行顯著性分析，采用Origin 2018繪制圖像。

2 結果與分析

2.1 單孢菌株的分離及驗證結果

由圖2-c～h可以看出，單子囊孢子在 1/2 PPDA培養(yǎng)基上呈放射狀生長，待其長至48 d左右時便能形成肉眼可見的菌落。通過冬蟲夏草單子囊孢子分離得到的菌株，是由單個子囊孢子發(fā)育而來的單系菌株，排除了組織分離菌株多菌雜合的可能，故其可靠性高于組織分離所得到的菌株，并通過ITS鑒定，確認所得單孢菌株為中國被毛孢(圖2-e)。以該菌株作為試驗材料可靠性更高，更具有說服力。同時，ITS鑒定結果也進一步佐證了冬蟲夏草的無性型是中國被毛孢。

2.2 光照處理對中國被毛孢菌落形態(tài)和菌絲生長的影響

2.2.1 光照處理對中國被毛孢菌落的影響 由圖3-a和圖3-c可以看出，光照處理對中國被毛孢菌落形態(tài)有顯著影響。在外形上光照處理后中國被毛孢菌落形態(tài)呈蚯蚓糞狀，菌落表面布有絨毛狀氣生菌絲，菌落外周布有明顯致密的黃色環(huán)狀菌絲帶，菌落直徑大小無顯著變化(表3)。在其他絲狀真菌的研究中已經(jīng)證明光照會對菌絲的生長有一定的抑制作用，且這種抑制作用是普遍存在的[27-28]。這與本試驗結果有所差異，究其原因可能與中國被毛孢菌絲生長特性有關。中國被毛孢生長緩慢，菌絲形態(tài)多是以基生菌絲為主，其形態(tài)結構與氣生菌絲有極大的區(qū)別，而光照對菌絲生長的抑制多數(shù)指的是對氣生菌絲的影響。另外，光照強度與光質(zhì)對菌絲生長的影響極大，本試驗采用的光照條件或許并未達到抑制中國被毛孢菌絲生長的條件也是極有可能的。

在色素沉積方面也有顯著影響。光照處理后菌落外周菌絲出現(xiàn)了明顯的黃褐色，菌落內(nèi)側變化不明顯，培養(yǎng)基內(nèi)色素沉積也顯著加深(圖3-b、3-d)。這種顏色上的差異說明光照處理可以促進中國被毛孢色素的形成，而這種促進作用極有可能與光保護機制的形成有關。在真菌色素的研究報道中相對較多的是類胡蘿卜素，對其合成代謝過程已有詳細報道[29]，其中光照對其合成有明顯的促進作用。尤其對于蛹蟲草而言，光照是其類胡蘿卜素產(chǎn)生的必要條件，且類胡蘿卜素的沉積有助于蛹蟲草光保護機制的形成[30]。對于本研究中所提到的色素是否也為類胡蘿卜素，有待進一步研究。

光照處理后菌落鮮質(zhì)量極顯著低于黑暗處理組，而干質(zhì)量卻無明顯變化(表3)。從這種變化可以看出光照處理對中國被毛孢總的生物量并沒有明顯的改變，但鮮質(zhì)量明顯低于黑暗處理組，這極有可能與菌落中自由水含量有關。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，光照處理組菌落平板表面有明顯的水珠凝結，但黑暗處理組并沒有發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象。由此可以推斷，光照處理可以加劇菌落平板中自由水的蒸發(fā)，從而使得光照處理組菌絲體的自由水含量低于黑暗處理組，進而影響鮮質(zhì)量，但由于總的生物量沒有改變，所以菌落干質(zhì)量并沒有明顯差異。

2.2.2 光照處理對中國被毛孢氣生菌絲的影響 由圖4-a和圖4-b可以看出，光照處理對中國被毛孢氣生菌絲生長有顯著影響，黑暗處理組的中國被毛孢氣生菌絲無明顯的扭結現(xiàn)象，而光照處理組的氣生菌絲出現(xiàn)扭結現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)光照可以誘導繡球菌的原基形成，在對照組黑暗處理下原基無法形成[31]。光照處理后菌絲扭結的出現(xiàn)，說明光照能夠促進中國被毛孢氣生菌絲形成扭結，而這種扭結的增多是否會影響后續(xù)原基的形成，這有待進一步驗證。

光照處理對于氣生菌絲的直線延伸有極顯著的影響，黑暗處理組氣生菌絲拐點間的平均長度約為42 μm，而光照處理組氣生菌絲拐點間的平均長度約為32 μm(表4)。由此可以看出，光照處理對氣生菌絲的延伸有抑制作用，這種抑制主要表現(xiàn)在氣生菌絲更易出現(xiàn)彎曲，延伸程度不及黑暗處理組。在植物生長發(fā)育過程中，光照會促使植物合成光敏色素，這種物質(zhì)會直接影響植物莖的伸長以及向光的敏感性[32]。真菌在受到光照處理后，也有可能會促使真菌產(chǎn)生類似的物質(zhì)，進而影響真菌菌絲的延伸。

光照處理對分生孢子數(shù)量的影響也極為顯著，黑暗處理組分生孢子量約為0.625×109個，光照處理組分生孢子量約為0.433×1010個，光照處理組約有黑暗處理組的7倍之多(表4)?？梢姽鈱τ诜稚咦拥男纬捎兄匾饬x，光照往往可以誘發(fā)有性和無形結構的形成。對于光在真菌中觸發(fā)產(chǎn)孢機制的形成，目前已有清楚的認知。當近紫外光照射到菌絲上時，菌絲中會產(chǎn)生一種被稱作P310的物質(zhì)，這種物質(zhì)可以促進分生孢子的產(chǎn)生[33]。由此可以推測出光照處理后中國被毛孢極有可能也會產(chǎn)生這種類似于P310的物質(zhì)，從而使得分生孢子數(shù)量明顯高于黑暗處理組。在其他絲狀真菌的研究中也有光照能夠促進分生孢子形成的大量報道[34-35]。這與本試驗結果類似，說明光照促進高等真菌分生孢子的形成是一種普遍現(xiàn)象，而非某個物種所特有。

2.3 不同條件下中國被毛孢活性物質(zhì)含量

由圖5可以看出，光照處理組與黑暗處理組相比，多糖與尿素含量差異極顯著，甘露醇與多酚含量差異不顯著。其中，甘露醇的含量在光照處理組的測定值為54.841±1.637 mg/g，黑暗處理組的測定值為50.254±1.213 mg/g。多糖含量在光照處理組的測定值為98.701±10.569 mg/g，黑暗處理組的測定值為172.552±4.633 mg/g。尿素含量在光照處理組的測定值為 5.304±1.852 mg/g，黑暗處理組的測定值為 26.787±1.176 mg/g。多酚含量在光照處理組的測定值為4.175±0.639 mg/g，黑暗處理組的測定值為6.386±0.525 mg/g。

由代謝物含量的變化可以看出，光照處理對中國被毛孢代謝活動有顯著的影響。多糖是生物體中最常見的初級代謝產(chǎn)物，作為生物體的主要碳源，用以合成其他含碳物質(zhì)。光照處理后中國被毛孢多糖含量顯著降低，極有可能是光照后促使中國被毛孢合成有關光保護機制的物質(zhì)(如色素含量的增加)，而大量消耗原有的多糖，促使光照組多糖含量顯著低于黑暗組。尿素由于其自身結構使其對調(diào)節(jié)細胞內(nèi)滲透壓有著重要作用[36]。由“2.2.1”中提到的菌絲體自由水含量減少可知，細胞滲透壓會隨著自由水的減少而升高，為了維持細胞滲透壓的平衡，可能會使細胞內(nèi)尿素含量有所降低，這可能與光照處理組尿素含量不及黑暗處理組有一定的關聯(lián)。而在其他真菌的相關研究中也有報道稱光照對真菌代謝有一定的抑制作用[37]，但對這種抑制作用并沒有足夠的解釋。

2.4 不同處理下腺苷的含量

通過UPLC測定腺苷標準品溶液得到圖6-A所示的腺苷標準品峰圖，出峰時間約為 2.2 min左右，由此可以推斷出圖6樣品組B圖和C圖所示的2.2 min對應的峰應為腺苷。通過積分函數(shù)求得樣品組腺苷峰圖面積，再將面積帶入回歸方程，最終得到黑暗處理組腺苷含量約為40.698±3.726 mg/L，光照處理組腺苷含量約為59.463±5.425 mg/L。

由上述不同處理組腺苷含量可以看出二者差異顯著。腺苷是冬蟲夏草中主要的活性物質(zhì)，其含量與藥用價值有著直接的聯(lián)系。由上述結果可以得出，光照處理會對中國被毛孢菌絲體中的腺苷含量產(chǎn)生顯著的促進作用。這說明給予中國被毛孢一定的光照會促進其合成腺苷，進而影響其藥用價值，所以光照可以作為中國被毛孢合理的生長條件加以應用。有關蛹蟲草的研究報道稱，藍光處理會對蛹蟲草菌絲體中腺苷類物質(zhì)含量有一定的抑制作用[37]，這與本試驗結論不符。究其原因可能與其所用的藍色單色光有一定聯(lián)系，也有可能是冬蟲夏草與蛹蟲草間存在一定的物種 差異。

3 討 論

關于光照處理后菌落鮮質(zhì)量下降的問題，需要探討的是這種現(xiàn)象產(chǎn)生的機制。本試驗所使用的是LED的冷色光源，并在18 ℃的恒溫條件下進行的試驗，所以光照并不會對培養(yǎng)環(huán)境的溫度產(chǎn)生明顯影響。對于水分的蒸發(fā)需要提升分子間的自由能才能提升其蒸發(fā)速率，在環(huán)境溫度不變的情況下是什么讓水分子間自由能改變，增加了其蒸發(fā)速率，這著實讓人費解。筆者猜測，雖然有培養(yǎng)箱控溫系統(tǒng)的存在，使得環(huán)境溫度并不會有明顯的變化。但是由于光照后平板內(nèi)的培養(yǎng)基會吸收一部分光能，而這部分光能會以熱能的形式進而促使培養(yǎng)基中自由水的蒸發(fā)，從而造成菌絲鮮質(zhì)量的差異，這需要更加精細的試驗設計來 確認。

關于光照處理后菌絲出現(xiàn)明顯的扭結現(xiàn)象，這種扭結是否會對將來原基的出現(xiàn)有一定影響，值得探討。筆者認為，這種扭結與后期原基的形成乃至子實體的形成關系并不大。一般在自然狀態(tài)下，冬蟲夏草在子實體發(fā)育啟動之前一直處于地底的黑暗條件下，是在無光的條件下啟動子實體發(fā)育的。故而，光照后出現(xiàn)的菌絲扭結與原基出現(xiàn)并無直接聯(lián)系。

在對真菌的研究中發(fā)現(xiàn)，不同真菌對不同波長光質(zhì)的反應不同，不同生長發(fā)育階段對光強、光質(zhì)的要求均有差異[38]。由于光照處理對中國被毛孢生長代謝影響的研究鮮有報道，因此，本試驗優(yōu)先選擇光質(zhì)為全光譜的植物生長調(diào)節(jié)光，根據(jù)其他真菌的最適光照條件將光照度定在300 lx左右，并沒有驗證不同光質(zhì)、不同光強對中國被毛孢的影響。因此，本研究所得到的光照對中國被毛孢生長代謝影響的結果都有可能會隨著光照條件的改變而發(fā)生變化，這些需要今后進一步深入研究。另外，對于本試驗發(fā)現(xiàn)的光照處理后所產(chǎn)生的色素，也需后續(xù)進一步研究其類別和性質(zhì)。

4 結 論

光照處理對中國被毛孢菌落形態(tài)產(chǎn)生顯著影響，色素沉著明顯加深，菌落鮮質(zhì)量顯著低于黑暗處理組，但總的生物量并沒有明顯改變；光照處理對中國被毛孢菌絲的直線延伸產(chǎn)生顯著的抑制作用，菌絲出現(xiàn)明顯的扭結現(xiàn)象，并且極顯著促進分生孢子的產(chǎn)生，數(shù)量是黑暗處理組的7倍之多；光照處理后中國被毛孢多糖和尿素含量顯著低于黑暗處理組，甘露醇與多酚含量無明顯變化；光照處理后中國被毛孢腺苷含量顯著高于黑暗處理組。