甜蕎 FeTCP1基因克隆及脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析

朱旭東，熊澤浩，徐 銳，曹 艷，侯澤豪，方正武

(長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北荊州 434025)

TCP是調(diào)控植物發(fā)育的特異性因子，具有一個(gè)非典型的約59個(gè)氨基酸的bHLH保守結(jié)構(gòu)域[1]。目前，已知TCP家族的成員可分為PCF亞家族和CIN和CYC/TB1亞家族[2]。PCF亞家族大部分成員的蛋白序列較短，基序組成較為保守，調(diào)控基因正向表達(dá)；CIN和CYC/TB1亞家族的成員存在一個(gè)富含精氨酸的基序(18～20個(gè)氨基酸)稱(chēng)為R結(jié)構(gòu)域，主要包含調(diào)控植物側(cè)生器官生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)育的基因[3-4]。PCF亞家族成員主要介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂的顯著刺激，CIN和CYC/TB1亞家族成員則協(xié)同抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂[5]。

TCP家族廣泛參與調(diào)控植物生長(zhǎng)、發(fā)育、非生物脅迫以及激素反應(yīng)等，與植物器官形態(tài)性狀的進(jìn)化密切相關(guān)，控制著花的對(duì)稱(chēng)性及葉的性狀表型[6]，還參與植株內(nèi)激素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。在番茄(Solanumlycopersicum)[8-10]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[5,11-13]、玉米(Zeamays)[14]、水稻(Oryzasativa)[15]等植物中證實(shí)TCP基因在植物逆境應(yīng)答方面發(fā)揮著作用。在擬南芥中AtTCP11通過(guò)上調(diào)VND7基因的表達(dá)量，來(lái)引起維管束發(fā)育的缺陷；AtTCP3、AtTCP15也是通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素來(lái)響應(yīng)相關(guān)的表達(dá)[12]；AtTCP5、AtTCP13、AtTCP17主要通過(guò)依賴(lài)和不依賴(lài)PITS兩個(gè)途徑來(lái)促進(jìn)生長(zhǎng)素的合成[4]。水稻的OsPCF2、OsPCF5、OsPCF6均涉及干旱和冷脅迫的耐受性[15]。

甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)是蓼科蕎麥屬植物，具有較強(qiáng)的抗逆能力。目前關(guān)于TCP家族成員在甜蕎中的研究相對(duì)較少。本研究以抗旱品種‘西農(nóng)9976’為試驗(yàn)驗(yàn)材料，利用同源克隆方法得到FeTCP1基因的CDS序列，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)FeTCP1基因序列和編碼蛋白序列進(jìn)行分析和鑒定，利用系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析不同物種間TCP1蛋白的親緣關(guān)系。同時(shí)在逆境脅迫下對(duì)FeTCP1基因在甜蕎幼苗的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。結(jié)合蛋白序列和實(shí)時(shí)熒光定量分析來(lái)預(yù)測(cè)TCP1基因在甜蕎中的表達(dá)模式。為T(mén)CP1基因在逆境脅迫下的功能分析提供理論基礎(chǔ)，將有助于進(jìn)一步研究TCP基因家族的進(jìn)化關(guān)系和分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試材料為甜蕎品種‘西農(nóng)9976’。篩選均一飽滿(mǎn)的蕎麥種子，經(jīng)0.1% HgCl 消毒5 min 后，用無(wú)菌水洗凈，置于培養(yǎng)皿中，25 ℃催芽。待根長(zhǎng)生長(zhǎng)到2 cm 左右時(shí)，將發(fā)芽一致的甜蕎種子移栽至水培盒，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：25 ℃ 12 h光照，20 ℃ 12 h黑暗；相對(duì)濕度恒定為60%。待培養(yǎng)7 d至甜蕎幼苗子葉完全展開(kāi)時(shí)，分別利用15% PEG 6000和0.1% NaCl溶液對(duì)甜蕎幼苗進(jìn)行脅迫處理，以處理0 h為對(duì)照，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。分別于脅迫后3 h、6 h、 12 h、24 h和48 h對(duì)甜蕎幼苗的子葉和根部進(jìn)行樣品采集，液氮速凍后，置于-80 ℃保存，備用。

1.2 FeTCP1基因的克隆

利用RNA試劑盒(RN38)提甜蕎幼苗葉片和根部的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA，根據(jù)長(zhǎng)江大學(xué)耐漬麥類(lèi)種質(zhì)資源實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序得到的cDNA序列，利用NCBI進(jìn)行Primer Blast設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增出FeTCP1序列。具體引物信息見(jiàn)表1。引物合成和DNA測(cè)序均由北京擎科生物公司完成。

表1 引物名稱(chēng)與序列Table 1 Primer name and sequence

1.3 FeTCP1基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)確定FeTCP1基因開(kāi)放式閱讀框(ORF)和氨基酸數(shù)目；利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)FeTCP1的氨基酸長(zhǎng)度、分子質(zhì)量(MW)；利用軟件NPS@(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)預(yù)測(cè)FeTCP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用NCBI進(jìn)行Protein Blast搜索同源序列，篩選雙子葉植物中的同源序列，用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，確定FeTCP1在各物種間的演化關(guān)系。

1.4 FeTCP1基因在干旱和鹽脅迫下的表達(dá) 分析

在甜蕎幼苗脅迫處理后分別提取其葉片和根部的總RNA，去除殘留的DNA后檢測(cè)其質(zhì)量與完整性，利用cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)，檢測(cè)FeTCP1基因在脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)模式。使用Primer進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，上、下游特異性引物分別為QFeTCP-RTF和 Q FeTCP-RTR(表 1)；qRT-PCR檢測(cè)所用的陽(yáng)性對(duì)照內(nèi)參基因?yàn)樘鹗w的ACTIN基因(Genbank登錄:HQ398855.1)，檢測(cè)特異性引物分別為QFeACTIN-F 和QFeACTIN-R(表1)。采用兩步法PCR擴(kuò)增程序，使用2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)量，用SPSS 19.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，用Microsoft excel 2003作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜蕎 FeTCP1基因的克隆

利用引物FeTCP1-F/FeTCP1-R對(duì)甜蕎品種‘西農(nóng)9976’的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，獲得1條1 800 bp左右的PCR產(chǎn)物(圖 1)。將目的條帶回收純化后，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。利用NCBI在線(xiàn)分析序列，開(kāi)放式閱讀框(ORF)為1 623 bp，編碼540個(gè)氨基酸。進(jìn)行Blast同源性搜索，結(jié)果與茶樹(shù)CsTCP1(XM_028267645.1)的同源性高達(dá)98%，將其命名為FeTCP1，GenBank登錄:MW092108。

2.2 FeTCP1基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1FeTCP1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 利用ExPASy預(yù)測(cè) FeTCP1蛋白的理化性質(zhì)。結(jié)果表明， FeTCP1蛋白的分子式為C2563H4256N716O797S24，分子質(zhì)量為58 623.75 ku，等電點(diǎn)為5.97，屬于弱酸性蛋白。疏水性總平均為-0.032，不穩(wěn)定系數(shù)為32.67，屬于親水性穩(wěn)定蛋白。在第96個(gè)氨基酸處疏水性最強(qiáng)，峰值達(dá)到2.756；在第264個(gè)氨基酸處的親水性最強(qiáng)，峰值達(dá)到-2.289。

2.2.2FeTCP1基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位及保守結(jié)構(gòu)域 利用WOLF PSORT進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果FeTCP1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，沒(méi)有分泌通道信號(hào)肽。利用NCBI/CD Search分析FeTCP1蛋白保守結(jié)構(gòu)域。其含有一個(gè)TCP1_alpha的保守結(jié)構(gòu)域，屬于TCP-1家族、α亞單位。

2.2.3 FeTCP1蛋白的氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化分析 利用DNAMAN 將FeTCP1蛋白的氨基酸序列與芝麻(SiTCP1)、木薯(MeTCP1)、橡膠樹(shù)(HbTCP1)和獼猴桃(AcTCP1)的TCP1氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析(圖 2)。結(jié)果表明，5個(gè)雙子葉植物間的蛋白氨基酸長(zhǎng)度基本一致，同源性達(dá)96.04%，表明TCP1在這幾個(gè)物種中存在較高的保守性。

將FeTCP1蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Protein Blast搜索，篩選40個(gè)雙子葉植物蛋白序列，用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。顯示甜蕎的FeTCP1與甜菜(XM_010683900.2)、睡蓮(XM_031646224.1)和罌粟(XM_026525527.1)親緣關(guān)系最近，其中甜菜同為藜科植物。而另一種蓼科植物烏草(XM_021424703.1)與 FeTCP1的親緣關(guān)系則相對(duì)較遠(yuǎn)。與FeTCP1親緣關(guān)系相對(duì)最遠(yuǎn)的是苦瓜(XM_022288799.1)。這些親緣關(guān)系符合植物形態(tài)學(xué)分類(lèi)及進(jìn)化規(guī)律。TCP1基因在甜蕎與甜菜中的較高同源性，推測(cè)FeTCP1基因在雙子葉藜科植物中存在著較高的保守性。

2.2.4 FeTCP1蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用NPS@預(yù)測(cè)FeTCP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。預(yù)測(cè)顯示FeTCP1蛋白由51.85%的α螺旋、 15.93%的延伸鏈、5.37%的β-轉(zhuǎn)角和26.85%無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)組成。利用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4)，顯示FeTCP1與模板6nr8.1.O的三級(jí)結(jié)構(gòu)序列同一性達(dá)66.35%，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

2.3 FeTCP1在干旱與鹽脅迫下的表達(dá)分析

初步分析FeTCP1在甜蕎組織中的功能，利用qRT-PCR定量分析甜蕎幼苗葉片和根部在干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)情況(圖5)。結(jié)果顯示在干旱處理下，F(xiàn)eTCP1在葉片中的表達(dá)量均高于對(duì)照，在干旱處理12 h左右達(dá)到峰值，其大致趨勢(shì)為先增后減；根的FeTCP1表達(dá)量均高于對(duì)照、葉片，在6 h達(dá)到峰值；在鹽處理下，發(fā)現(xiàn)FeTCP1的表達(dá)情況較為復(fù)雜，組織之間存在差異，葉片中FeTCP1的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，12 h后顯著高于根的表達(dá)量。在根中則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在3 h左右達(dá)到峰值，之后逐漸下降。

3 討 論

TCP基因在植物中廣泛存在，已在擬南芥[5,11-13]、水稻[15]、玉米[14]、番茄[8-10]等植物中發(fā)現(xiàn)TCP參與植物脅迫后的應(yīng)答反應(yīng)[16]。水稻OsPCF2蛋白可通過(guò)與NHX1基因的啟動(dòng)子結(jié)合激活其表達(dá)而提高鹽耐受性[17]，OsTCP19的過(guò)表達(dá)可通過(guò)上調(diào)IAA3、ABI3、ABI4和下調(diào)LOX2誘導(dǎo)一些信號(hào)通路從而提高擬南芥對(duì)干旱與高鹽脅迫的耐受性[18]。大多數(shù)TCP基因的上游區(qū)域至少包含一種激素相關(guān)元件，啟動(dòng)子中包含一個(gè)或多個(gè)與脅迫相關(guān)的元件，但激活的時(shí)間存在差異[19]。TCP在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)節(jié)對(duì)于植物響應(yīng)多變的環(huán)境條件的發(fā)育可塑性至關(guān)重要[20]。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)TCP基因在干旱脅迫中轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均出現(xiàn)下調(diào)，僅且存在少量上調(diào)基因。這些研究證實(shí)TCP成員參與了干旱脅迫的反應(yīng)過(guò)程，同時(shí)，推測(cè)出TCP成員在植物器官形態(tài)建成[21-24]、逆境應(yīng)答中的功能特性[19]。

本研究從甜蕎中克隆出的FeTCP1共編碼540個(gè)氨基酸，從功能結(jié)構(gòu)域分析表明，F(xiàn)eTCP1基因具有TCP1_alpha典型結(jié)構(gòu)域?qū)儆赥CP-1家族-α亞單位。這些蛋白通常是由兩個(gè)堆疊環(huán)組成的雙圓環(huán)結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)多種細(xì)胞間隔中ATP依賴(lài)的多肽鏈折疊。通過(guò)選取不同雙子葉植物的同源序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，F(xiàn)eTCP1與甜菜、睡蓮和罌粟親緣關(guān)系最近，與苦瓜的親緣關(guān)系相對(duì)最遠(yuǎn)，表明TCP1基因在雙子葉藜科植物中存在著較高的同源保守性。本研究中FeTCP1基因在PEG與鹽誘導(dǎo)脅迫過(guò)程中葉片和根部中的表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)，證實(shí)FeTCP1參與干旱脅迫調(diào)控，與前人研究相似[7,9]。但本研究中FeTCP1基因?qū)儆赥CP家族中少數(shù)上調(diào)基因，且FeTCP1的表達(dá)量在48 h的脅迫處理下先增后減。與其他研究不盡相同，這種差異可能由于物種間差異以及植物的生長(zhǎng)發(fā)育階段的變化所導(dǎo)致。

甜蕎FeTCP1可以響應(yīng)15% PEG 6000和0.1% NaCl鹽脅迫，證實(shí)FeTCP1基因參與干旱脅迫的應(yīng)答調(diào)控。干旱響應(yīng)機(jī)制主要包括光合作用、滲透調(diào)節(jié)、抗氧化系統(tǒng)以及各種蛋白質(zhì)和代謝物合成等，主要涉及滲透穩(wěn)態(tài)、脅迫傷害控制和生長(zhǎng)控制3個(gè)方面。下一步的研究方向?yàn)橥ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)探究FeTCP1主要參與干旱響應(yīng)的哪些過(guò)程以及具體的調(diào)控機(jī)理機(jī)制，為培育優(yōu)良的抗逆品種提供借鑒。