四環(huán)素和砷對斑馬魚的聯(lián)合毒性及機制

李 歡,張靜麗,張詩雨,石明浩,謝 年,周柔靜,劉 蘇 (中國藥科大學(xué)工學(xué)院環(huán)境科學(xué)教研室,江蘇 南京 211198)

近年來抗生素被廣泛應(yīng)用于疾病防治、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域[1],在使用的過程中,大部分抗生素被生物體排出體外,造成了其在環(huán)境中的大量積累.其中,四環(huán)素類(TCs)抗生素因成本低、抗菌譜廣而成為動物醫(yī)療中應(yīng)用最廣泛的抗生素之一[2].盡管環(huán)境水體中 TCs的檢出濃度很低,但由于其在養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)中被長期頻繁使用,殘留在環(huán)境中的 TCs總量大,對水生生態(tài)系統(tǒng)和人體健康構(gòu)成極大的潛在威脅.研究表明,TCs及其代謝產(chǎn)物在水體中不僅會誘導(dǎo)生物產(chǎn)生抗性基因,還會對水生生物及人類產(chǎn)生潛在的毒性效應(yīng)[3].其中,鹽酸四環(huán)素(TET)作為重要的 TCs之一,在環(huán)境中分布范圍廣、積累濃度高且不易降解,更應(yīng)值得關(guān)注[4-5].TET能夠抑制或誘導(dǎo)還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性,并對魚類造成嚴重的 DNA損傷和免疫毒性[6].因此,TET在水生環(huán)境中的大量殘留帶來的潛在風(fēng)險不容忽視.

在實際水環(huán)境中,TET往往與一種或多種毒害污染物共存,污染物共存的多樣性使得復(fù)合污染物的形態(tài)和毒性效應(yīng)更為復(fù)雜[7].研究表明,TET可能會影響其他共暴露污染物的毒性效應(yīng).例如,TET與Cu聯(lián)合暴露時會發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),降低 Cu的生物可利用度,進而顯著降低Cu對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性,表現(xiàn)出拮抗作用[1].TET和納米二氧化鈦(TiO2-NPs)聯(lián)合暴露時會增加 TiO2-NPs與大腸桿菌細胞接觸的面積,抑制細胞內(nèi)外的物質(zhì)運輸,導(dǎo)致細胞的代謝中斷或死亡,表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用[8].砷(As)是一種高毒的環(huán)境污染物,廣泛存在于世界各地的環(huán)境水體中[9].As的廣泛分布極大地增加了其與TET共存的可能性.As的過量攝入會顯著增加人群健康風(fēng)險[10],氧化應(yīng)激被認為是As對水生生物和哺乳動物產(chǎn)生毒性最重要的致毒機制[11].TET的重要致毒機制之一也是通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激效應(yīng)對斑馬魚等水生生物造成損傷[12].TET和As聯(lián)合暴露時是否會通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對水生生物產(chǎn)生更為嚴重的損傷尚不清楚.鑒于此,有必要對 TET和 As的聯(lián)合毒性進行評估.

由于斑馬魚具有發(fā)育快、繁殖力強和遺傳同源性高等優(yōu)勢,是研究環(huán)境污染物毒性效應(yīng)和環(huán)境風(fēng)險的重要模式物種[13],在污染物的聯(lián)合毒性研究中也被廣泛使用.因此,為探究 TET和 As聯(lián)合暴露下對水生生物的毒性效應(yīng),本文選用斑馬魚作為模式生物,結(jié)合組織病理學(xué)、基因表達、As的含量測定和腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的變化來評估TET和As的聯(lián)合毒性效應(yīng),旨在為TET和As的環(huán)境風(fēng)險評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料和方法

1.1 實驗動物和暴露實驗設(shè)計

實驗使用4月齡、健康狀態(tài)良好的雄性斑馬魚,購于中國科學(xué)院水生生物研究所(武漢),使用容積為14L并配有LED燈和曝氣裝置的魚缸進行飼養(yǎng),每缸飼養(yǎng)60條斑馬魚.養(yǎng)殖水選用經(jīng)紫外燈照射、除氯 24h的自來水,水溫控制(26±0.5)℃,pH 值控制在7～8,明暗周期為 14h/10h.每天早晚投喂豐年蝦幼蟲(豐年蝦卵在海鹽水中曝氣孵化 24h后使用分離器過濾得到).馴化1周后,斑馬魚隨機分為4組,暴露方案見表 1.根據(jù)文獻調(diào)研,我國多地地表水和地下水中TET和As的檢測濃度已達到10～50μg/L[8]和10～100μg/L[10],結(jié)合早期對TET和As毒性評估時使用的暴露濃度[4,14],本實驗設(shè)置TET和As的暴露濃度分別為50和100μg/L.實驗中TET購于上海源葉生物科技有限公司.As(Ⅲ) (As(Ⅲ)ICP-MS標準液)購于上海安譜實驗科技股份有限公司.在實驗過程中,每天更換1/3左右養(yǎng)殖水.暴露21d后,對斑馬魚進行冰凍處死,使用直尺和分析天平分別記錄斑馬魚的體長和體重.隨后對斑馬魚進行解剖,采集腸道、肝臟和腸內(nèi)容物樣品.剪取部分腸道和肝臟放入提前裝有1mL福爾馬林(4%甲醛)固定液(西隴科學(xué)股份有限公司)的EP管中.將剩余腸道、肝臟和腸道內(nèi)容物放置于凍存管內(nèi)使用液氮速凍后置于-80℃冰箱保存用于后續(xù)分析.

表1 實驗暴露方案Table 1 Exposure strategy used in this study

1.2 組織病理學(xué)檢測

將斑馬魚腸道和肝臟組織在 10%福爾馬林緩沖液中固定24h,用70%、80%、90%、100%乙醇逐級脫水,將脫水后的組織先后浸漬于無水乙醇、二甲苯混合液及純二甲苯中進行透明處理,隨后經(jīng)石蠟包埋,垂直切成4μm切片黏附于載玻片上烘干備用.切片在著色前用二甲苯脫蠟,然后經(jīng)乙醇溶液水化處理.使用蘇木精-曙紅(HE)染色,在100、200和400倍光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照,記錄不同暴露組斑馬魚的組織病理學(xué)變化.

1.3 RNA的提取及實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測

斑馬魚腸道和肝臟組織樣本的 RNA提取使用RNA 提取試劑盒(Takara,日本)進行,利用超微量分光光度計(Thermo NanoDrop 2000,美國)檢測總RNA的純度和濃度,以O(shè)D260/OD280作為RNA純度的指標.對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為 PrimeScriptRT reagent kit(TaKaRa,日本).以cDNA為模板進行RT-qPCR反應(yīng).RT-qPCR擴增條件如下:95℃預(yù)變性30s;95℃變性10s,60℃退火30s,循環(huán)反應(yīng) 40次;循環(huán)完成后,將溫度升至 95℃,持續(xù)15s,然后升至60℃,持續(xù)1min,最后加熱至95℃,以獲得聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物的溶解曲線.以 β-action作為內(nèi)參,使用 2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析,比較各組目的基因表達的差異.目的基因與內(nèi)參引物序列如表2所示.

表2 目標基因的qPCR引物序列Table 2 qPCR primer sequence of target gene

1.4 16S rRNA測序及生物信息學(xué)分析

每組中隨機選取6條斑馬魚的腸道內(nèi)容物作為1個樣本.采用DNA提取試劑盒(FastDNA? Spin Kit,MP Biomedicals, USA)提取樣本中的 DNA.使用PCR純化試劑盒(QIAquick PCR Purification Kit,QIAGEN, Germany)對得到的 PCR產(chǎn)物進行純化.PCR 擴增體系為:2*taq PCR mix:25μL Primer F(10μmol/L):1μL; Primer R(10μmol/L):1μL; gDNA:2～10μL; ddH2O:補足 50μL 體系 PCR 擴增程序:1、95℃ 5min; 2、94℃ 1min; 3、57℃ 45s; 4、72℃ 1min,2～4步34個循環(huán); 5、72 ℃ 10min; 6、16℃ 5min.選取 16S V3-4區(qū)域進行擴增,該區(qū)域引物序列為:341F:CCTAYGGGRBGCASCAG; 806R:GGACTACNNGGGTATCTAAT.將純化后的PCR產(chǎn)物在Ion S5TMXL高通量測序平臺上測序.對原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾和處理以除去低質(zhì)量的干擾數(shù)據(jù).將預(yù)處理后的測序數(shù)據(jù)利用 QIIME軟件作進一步的物種分類,對所有樣品測序數(shù)據(jù)的Effective Tags以97%的相似性將序列聚類成為OTU,并對OTU的代表序列進行物種注釋.

1.5 電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)分析

將液氮速凍后的腸道和肝臟新鮮樣品放入凍干機中冷凍干燥.稱量約 25mg的凍干樣本,并加入2mL36%的硝酸與2mL 40%的雙氧水.經(jīng)加熱消解、趕酸和超純水稀釋定容至 1mL.組織提取液過0.22μm 濾膜,利用 ICP-MS (Agilent 7700,安捷倫科技有限公司)在KED模式下測定As含量.

1.6 數(shù)據(jù)分析

運用GraphPad prism 7.0軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,對照組和實驗組之間的差異采用單因素方差分析.實驗所有數(shù)據(jù)以(平均值±標準偏差)來表示.所有的統(tǒng)計結(jié)果中以P<0.05視為具有顯著性差異.

2 結(jié)果分析

2.1 TET或/和As對斑馬魚表型特征的影響

如圖1所示,與對照組相比,TET或As的單獨暴露未導(dǎo)致明顯的體長變化.而TET和As聯(lián)合暴露處理導(dǎo)致斑馬魚的體長顯著地降低(P<0.05).此外,與TET或As單獨暴露時相比,TET和As聯(lián)合暴露時體長的減小也存在顯著性差異(P<0.05).與對照組相比,所有實驗組的體重均無顯著性變化(P>0.05),而與TET組相比,TET和As的聯(lián)合暴露顯著地改變了斑馬魚的體重(P<0.05).結(jié)果表明TET和As的聯(lián)合暴露顯著加重了其單獨暴露時對斑馬魚體長和體重的影響.

圖1 TET或/和As的暴露對斑馬魚體長和體重的影響Fig.1 Effects of TET or/and As exposure on body length and weight of zebrafish

2.2 TET或/和 As對腸道和肝臟組織病理學(xué)的 影響

利用HE染色觀察腸道和肝臟的組織病理學(xué)變化.如圖2所示,在對照組中腸絨毛整體形態(tài)比較完整,腸上皮細胞排列規(guī)則整齊,無明顯的損傷.在TET組發(fā)現(xiàn)了輕微的腸粘膜上皮細胞脫落現(xiàn)象(藍色圓圈).As組出現(xiàn)了輕微的腸壁破裂的現(xiàn)象(黑色箭頭).TET+As組出現(xiàn)了明顯的炎性細胞浸潤(綠色箭頭)并伴有出血的現(xiàn)象(橙色圓圈).肝臟的鏡檢結(jié)果與腸道相似,如圖3所示,對照組的肝臟排列規(guī)則整齊,未見明顯的病變現(xiàn)象.而在 TET組中,觀察到了少量炎性細胞浸潤的現(xiàn)象(綠色箭頭).在As組中出現(xiàn)了肝索紊亂、竇間隙擴大的現(xiàn)象(紅色箭頭).在TET和As聯(lián)合暴露組中觀察到擴張的肝血竇中浸潤大量炎性細胞(綠色箭頭),局部血管周圍出現(xiàn)出血的現(xiàn)象(橙色圓圈).組織病理學(xué)結(jié)果表明,TET和As的聯(lián)合暴露顯著加重了其單獨暴露時對腸道和肝臟組織的損傷.

圖2 斑馬魚腸道HE染色切片F(xiàn)ig.2 HE staining section of zebrafish intestine

圖3 斑馬魚肝臟HE染色切片F(xiàn)ig.3 HE staining section of zebrafish liver

2.3 TET或/和 As對腸道和肝臟重要功能基因表達的影響

腸道的功能性基因表達結(jié)果如圖 4(a)所示.與對照組相比,腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達水平在TET組和 As組均沒有顯著變化,而在 TET+As組TNF-α的表達水平顯著地上調(diào) 3.05±0.55倍(P<0.05).與TET和As的單獨暴露相對比,TET和As的聯(lián)合暴露也明顯地增加了 TNF-α的表達水平(P<0.05).P-糖蛋白(P-gp)基因的表達在TET組和As組均沒有顯著差異,而在TET和As聯(lián)合暴露組中顯著地下調(diào),與As組相比,TET和As聯(lián)合暴露組中P-gp的表達也顯著地下調(diào).與TET和As的單獨暴露相對比,谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和原癌基因(C-jun)的表達在 TET+As組中均顯著上調(diào).緊密連接蛋白(Claudin-1, Occludin)基因的表達在所有實驗組中均無顯著性差異(P>0.05).腸道基因檢測的結(jié)果表明TET和As的聯(lián)合暴露會顯著地加重其單獨暴露時對腸道造成的損傷且這種損傷與腸道通透性的相關(guān)性不大.

圖4 斑馬魚腸道和肝臟功能基因的表達Fig.4 Expression of intestinal and liver functional genes in zebrafish

肝臟的功能基因表達結(jié)果如圖 4(b)所示,與對照組相比,As和TET+As組中的TNF-α的表達水平顯著上調(diào)(P<0.05),分別上調(diào)了(1.42±0.25)和(2.45±0.45)倍.與 TET和 As的單獨暴露相對比,TET和As的聯(lián)合暴露顯著地增加了 TNF-α的表達(P<0.05).過氧化氫酶(CAT)和GPx的表達在TET組均沒有顯著性變化,而TET+As組中CAT和GPx基因的表達顯著上調(diào).此外,C-jun和腫瘤抑制基因(p53)的表達水平在 TET+As組中也顯著增加(P<0.05).與TET和As的單獨暴露相對比,TET和As的聯(lián)合暴露明顯地增加了CAT、GPx、C-jun和p53的表達水平(P<0.05).MRP2(多藥耐藥相關(guān)蛋白-2)基因的表達在TET和TET+As組中均顯著地下調(diào),與As組相比, TET和As的聯(lián)合暴露顯著地下調(diào)了 MRP2的表達水平.上述結(jié)果表明 TET和 As的聯(lián)合暴露也會顯著增加TET和As單獨暴露時對斑馬魚肝臟的損傷.

2.4 TET對As在腸道和肝臟分布的影響

利用ICP-MS檢測As在斑馬魚腸道和肝臟的分布.腸道中 As的濃度如圖 5(a)所示,與對照組相比,As和 TET+As組中 As的濃度均顯著性增加(P<0.05),分別達到(461.68±20.35ng/g)和(704.15±24.50ng/g).與TET組和As組相比,TET和As的聯(lián)合暴露顯著地增加了As在斑馬魚腸道中的積累.肝臟中 As的濃度如圖 5(b)所示,與對照組相比,As和TET+As組中As的濃度均顯著性增加(P<0.05),分別為(322.39±22.28),(458.35±24.25)ng/g.此外,與 TET和As單獨暴露時相比,TET與As的聯(lián)合暴露也顯著性增加了As的積累(P<0.05).對As在腸道和肝臟化學(xué)檢測的結(jié)果表明TET和As的共暴露增加了腸道和肝臟中As的積累.

圖5 砷在腸道和肝臟中的濃度Fig.5 The concentration of As in intestine and liver

2.5 TET或/和As對腸道微生物群落的影響

基于 OTU 水平,對樣本進行主成分分析(PCA)來確定不同暴露組間微生物群落的分布特征,其中每一個點表示一個斑馬魚腸道內(nèi)容物樣本,相同顏色的點表示來自同一個處理組,兩點之間的距離越近表明兩樣品間的群落構(gòu)成差異越小.如圖 6(a)所示,TET組、As組和對照組相比均有明顯的區(qū)分,而TET+As組與對照組差異性不大,這表明TET和As的單獨暴露對腸道微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著地影響,但TET和As的聯(lián)合暴露對腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)影響較小.如圖6(b)所示,與對照組相比,TET和As的單獨暴露分別引起5825和3869種不同微生物發(fā)生變化,而TET和As聯(lián)合暴露僅引起623種不同的微生物發(fā)生變化.該結(jié)果也表明TET或As的單獨暴露顯著地擾亂了腸道微生物群落結(jié)構(gòu),而TET和As的聯(lián)合暴露對腸道微生物群落的影響較小.為觀察斑馬魚腸道微生物在門(phylum)水平上的相對豐度,選取在門水平上的豐度信息,生成相對豐度堆積圖.結(jié)果如圖7所示,可以發(fā)現(xiàn)變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)是斑馬魚腸道中的絕對優(yōu)勢菌.與對照組相比,TET的暴露導(dǎo)致變形菌門的豐度從 38%上調(diào)至 87%,As的暴露導(dǎo)致放線菌門的豐度從 15%上調(diào)至 52%,TET和As的聯(lián)合暴露與對照組無明顯差異.經(jīng)典聚類分析(圖7a)的結(jié)果也表明TET組和As組與對照組相比有明顯的區(qū)別,此外,TET組與對照組相比相距較遠,這表明 TET是影響腸道微生物群落變化的主要因素.

圖6 斑馬魚腸道微生物的主坐標分析和韋恩圖Fig.6 Principal coordinate analysis and venn diagram of zebrafish intestinal microorganism

圖7 斑馬魚腸道微生物經(jīng)典聚類分析和相對豐度Fig.7 Classical cluster analysis and relative abundance of intestinal microorganism

3 討論

TET和As在水環(huán)境中的廣泛分布對環(huán)境和人體健康存在嚴重風(fēng)險.盡管TET和As各自的毒性效應(yīng)已有不少文獻報道,但關(guān)于TET和As同時暴露的聯(lián)合毒性效應(yīng)及其機制的研究鮮有報道.本研究以斑馬魚為模式生物,研究了 50μg/L TET和 100μg/L As的單一暴露和聯(lián)合暴露對斑馬魚腸道和肝臟的影響.結(jié)果表明50μg/L TET的暴露能夠輕微地導(dǎo)致斑馬魚腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞,肝臟炎性細胞浸潤.100μg/L As的暴露可引起斑馬魚腸壁破裂,肝索紊亂和竇間隙擴大.此外TET和As的單一暴露均能夠誘導(dǎo)斑馬魚腸道和肝臟一定程度的氧化損傷并誘導(dǎo)腸道微生物群落發(fā)生顯著的變化.與TET和As的單一暴露相比,TET和 As的聯(lián)合暴露能夠顯著增加氧化應(yīng)激、炎癥因子和凋亡因子相關(guān)基因的表達,加重腸粘膜的纖毛損傷和出血,誘導(dǎo)肝臟血管周圍出血和炎性細胞浸潤.此外還發(fā)現(xiàn)兩者的聯(lián)合暴露顯著增加了 As在腸道和肝臟的累積,這可能是造成 TET和As對斑馬魚腸道和肝臟的協(xié)同毒性的主要原因.

TET進入水環(huán)境導(dǎo)致的生態(tài)毒性效應(yīng)已經(jīng)引起人們的高度關(guān)注.據(jù)報道,20μg/L TET能夠造成斑馬魚胚胎或幼蟲體長縮短、孵化延遲和卵黃囊面積增加等[13].100μg/L TET的暴露可造成腸道微生物群落結(jié)構(gòu)紊亂,以及肝臟脂肪積累[15].本研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)論,50μg/L TET能夠顯著地增加斑馬魚腸道中變形菌門的豐度,并誘導(dǎo)肝臟組織出現(xiàn)少量炎性細胞(圖3,圖7).有研究認為,氧化應(yīng)激是污染物導(dǎo)致動物體內(nèi)誘發(fā)毒性和疾病發(fā)生的重要機制.在抗氧化防御系統(tǒng)中,CAT和SOD是抵抗ROS的第一道防線,SOD能夠催化 O2-轉(zhuǎn)變成 H2O2,最后在CAT或GPx的作用下轉(zhuǎn)變成H2O[16].GPx是一種重要的抗氧化酶,可作為環(huán)境污染物誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的生物標志物[17].本研究發(fā)現(xiàn)TET暴露能顯著增加腸道中GPx基因的表達,這可能由于TET的暴露誘導(dǎo)斑馬魚腸道產(chǎn)生過量的 ROS,激活氧化系統(tǒng),從而使GPx表達上調(diào).以上數(shù)據(jù)證實了TET對斑馬魚的生態(tài)毒性.

研究表明,As會在白粉魚的肝、腎和腸等臟器中積累,并對肝、腎和腸道造成病理學(xué)損傷[14].本研究證實100μg/L As的暴露能夠顯著誘導(dǎo)斑馬魚肝臟炎癥因子(TNF-α)的表達上調(diào),破壞腸道上皮細胞進而造成組織病理損傷.As誘導(dǎo)生物毒性的潛在機制被認為與氧化應(yīng)激有關(guān)[11].As可以誘導(dǎo) ROS的增加,破壞蛋白質(zhì)和 DNA或與構(gòu)成細胞膜的脂肪發(fā)生化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生更具破壞性的脂質(zhì)自由基,進而破壞細胞膜的完整性和功能[17].本研究表明 As的暴露能夠顯著上調(diào)斑馬魚肝臟中 GPx基因的表達,進一步證實了氧化應(yīng)激在 As誘導(dǎo)斑馬魚毒性中的作用.

TET和As的共暴露進一步加劇了對斑馬魚毒性的復(fù)雜性.本研究發(fā)現(xiàn),與 TET和 As的單一暴露相比,TET和As的聯(lián)合暴露對斑馬魚的腸道和肝臟的毒性效應(yīng)具有協(xié)同作用.As與環(huán)境污染物的協(xié)同效應(yīng)在其他研究中也有報道.例如,As和阿特拉津都具有潛在的致畸性和遺傳毒性,并可引起斑馬魚胚胎的氧化應(yīng)激,聯(lián)合暴露時形成毒性更強的中間代謝物,造成對斑馬魚的更高毒性[18].As和甲基化硒化合物聯(lián)合暴露時,能夠阻斷部分甲基化形式的解毒過程(如甲基化),引起氧化應(yīng)激水平的提高,表現(xiàn)出明顯的協(xié)同毒性[19].本研究表明TET和As聯(lián)合暴露能夠明顯地增加氧化應(yīng)激、炎癥因子和凋亡因子的表達,對斑馬魚的腸道和肝臟造成更嚴重的損傷.

As的毒性在TET和As的協(xié)同毒性中發(fā)揮著重要的作用.As的毒性效應(yīng)與其形態(tài)有著密切聯(lián)系,通常認為 As(Ⅴ)的毒性遠遠低于 As(Ⅲ)[20-21].早期的研究表明腸道微生物群落的變化可能會導(dǎo)致 As的毒性發(fā)生改變.例如,某些腸道微生物能夠?qū)?As(Ⅲ)主動代謝為As(Ⅴ),從而導(dǎo)致As的毒性發(fā)生改變[22].本研究發(fā)現(xiàn)TET和As暴露能夠明顯地影響斑馬魚腸道中變形菌門和放線菌門等優(yōu)勢菌群的豐度,而TET和As的聯(lián)合暴露對腸道微生物群落結(jié)構(gòu)影響不大,這個結(jié)果表明腸道微生物群落的變化并非是造成TET和As的協(xié)同毒性的原因.微生物群落的變化與環(huán)境污染物毒性效應(yīng)的表征并非完全一致,這一現(xiàn)象在文獻中曾被報道,如口服納米銀(AgNPs)誘導(dǎo)小鼠腸道和肝臟嚴重的炎癥和氧化損傷,而小鼠腸道微生物群的組成、結(jié)構(gòu)和多樣性并未發(fā)生明顯變化[23].推測這可能與PCA分析方法有關(guān),首先PCA是建立在微生物DNA提取的基礎(chǔ)上進行分析,據(jù)文獻報道目前腸道微生物提取效率有限,部分微生物并未被提取到[24],其次,PCA的分析是研究腸道菌群的整體差異,忽略了特異性[25],本研究中腸道和肝臟具體毒性指標屬于特異性指標,相對于整體微生物群落的變化指標屬于不同的體系,這可能是導(dǎo)致TET和As聯(lián)合暴露下微生物菌群的變化與毒性效應(yīng)表征不一致的原因.另外,斑馬魚腸道微生物優(yōu)勢菌群主要有厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門等,當起毒性作用的屬于少部分微生物時,由于其變化在整個微生物群中所占的比例很小,導(dǎo)致其在 PCA中沒有體現(xiàn)出來時,可能也會導(dǎo)致微生物的結(jié)果和聯(lián)合毒性的結(jié)果不同[26].據(jù)以往文獻報道,生物有效性的變化對污染物的毒性也有顯著的影響,如納米二氧化鈦(TiO2)的加入能夠顯著增強斑馬魚幼魚對鉛的生物累積和吸收,并增強鉛對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育毒性,導(dǎo)致斑馬魚幼魚甲狀腺內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂[27].Cu會增加氟喹諾酮類化合物(FQS)在斑馬魚腸道和肝臟中的積累,進而造成嚴重的損傷[28].本研究中TET的存在顯著地增加了As在腸道和肝臟的積累,進而誘導(dǎo)對腸道和肝臟更嚴重的損傷.腸道通透性對污染物在生物體內(nèi)的積累有顯著的影響.正常的腸道黏膜屏障能夠有效阻止污染物進入機體,保護機體不受外界的侵害[29].然而據(jù)報道腸道通透性的破壞會顯著地增加污染物在腸道和肝臟中的積累,進而對腸道和肝臟造成一定的損傷[30].Occludin是一種腸上皮緊密連接蛋白,在腸屏障中發(fā)揮重要作用,它對于維持腸粘膜通透性至關(guān)重要[31].本研究發(fā)現(xiàn) Occludin基因的表達水平在各實驗組中均無顯著性差異,這表明TET和As的協(xié)同毒性可能與腸道通透性的變化無關(guān).P-gp是位于小腸粘膜上皮細胞的膜轉(zhuǎn)運蛋白,能夠?qū)⑦M入細胞的外源化學(xué)物以主動轉(zhuǎn)運的方式泵出細胞外,對進入細胞內(nèi)的物質(zhì)生物利用度有顯著影響[32].前人的研究表明mdr1a/1b雙基因敲除的小鼠由于P-gp蛋白的活性受到抑制,會導(dǎo)致As的排出受到限制,組織中的As蓄積增加,顯著地加劇了As的急性毒性[33].本研究發(fā)現(xiàn)TET和As的聯(lián)合暴露能夠明顯下調(diào)P-gp基因在腸道的表達.基于以上分析,推測 TET和 As的聯(lián)合暴露導(dǎo)致斑馬魚腸道中 P-gp基因的活性受到抑制,使As的外排量減少,增加了As在腸道的積累,部分As通過血液循環(huán)到達肝臟,對腸道和肝臟造成嚴重的損傷.

4 結(jié)論

4.1 TET和As的單一暴露可導(dǎo)致斑馬魚腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞,肝臟炎性細胞浸潤,并誘導(dǎo)斑馬魚腸道和肝臟一定程度的氧化損傷.

4.2 與TET和As的單一暴露相比,TET和As的聯(lián)合暴露對斑馬魚的腸道和肝臟均產(chǎn)生明顯的協(xié)同毒性,這可能與P-gp基因被抑制介導(dǎo)的As蓄積增加有關(guān).