進(jìn)水亞硝氮限制下Anammox去除氨氮研究

牛晚霞,袁林江,有小龍,牛澤棟 (西安建筑科技大學(xué),陜西省環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710055)

與傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)相比,厭氧氨氧化(Anammox)因不需要曝氣、不需要有機(jī)碳源、污泥產(chǎn)量低等明顯優(yōu)勢(shì),被公認(rèn)是一種效率高、能耗低的生物脫氮處理技術(shù)[1-3].相關(guān)研究[4]提出Anammox反應(yīng)中氨氮去除量與亞硝氮去除量以及硝氮產(chǎn)生量之間(ΔNH4+-N/ΔNO2--N/ΔNO3--N)的理論比值為1:1.32:0.26.由 于 AnAOB(Anaerobic ammonium oxidation bacteria)很難進(jìn)行純培養(yǎng),當(dāng) Anammox體系中存在異養(yǎng)型亞硝酸鹽氧化菌或反硝化菌時(shí),利用微生物內(nèi)碳源消耗部分亞硝氮,使 ΔNO2--N/ΔNH4+-N大于1.32[5].然而,有許多Anammox研究[6-8]得到ΔNO2--N/ΔNH4+-N小于1.32,即氨氮被超量去除.且當(dāng)進(jìn)水中亞硝氮供給比例減少時(shí),Anammox反應(yīng)器會(huì)出現(xiàn)氨氮相對(duì)更多的去除[9].

在 Anammox體系中通過(guò)研究氨氮和硫酸鹽轉(zhuǎn)化途徑時(shí)發(fā)現(xiàn)在NO2-缺失且 SO42-未被去除的情況下,NH4+就能穩(wěn)定去除,認(rèn)為該體系中氨氮的去除存在其他未知的電子受體[10].有研究[11]根據(jù)Anammox化學(xué)模型,從化學(xué)平衡移動(dòng)的角度對(duì)此進(jìn)行了分析,但對(duì)其中微生物機(jī)理尚不清楚.減少進(jìn)水NO2--N進(jìn)行厭氧氨氧化脫氮,可減少?gòu)U水中亞硝化過(guò)程、且還能保證廢水中氨態(tài)氮的去除量,對(duì)污水脫氮處理具有重要實(shí)用價(jià)值.

本研究設(shè)計(jì)了一系列批式實(shí)驗(yàn),探究了Anammox反應(yīng)器中氨氮超量去除方式以及超量去除氨氮量的限制性因素,同時(shí)結(jié)合微生物菌群解析對(duì)氨氮去除的代謝途徑進(jìn)行分析,旨在為厭氧氨氧化直接脫除水中氨態(tài)氮技術(shù)開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)裝置及進(jìn)水水質(zhì)

實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)玻璃制作的 UASB反應(yīng)器(圖1),有效體積 6.28L,總體積10.5L.反應(yīng)器內(nèi)側(cè)柱高114.4cm,直徑100mm,壁厚5mm,外側(cè)為32℃水浴保溫層,厚 10mm;在保溫層外包裹鋁箔紙進(jìn)行隔光,進(jìn)水由蠕動(dòng)泵打入反應(yīng)器底部.實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,該反應(yīng)器在室溫條件下饑餓放置 120d后提供基質(zhì)短期恢復(fù)為氮去除負(fù)荷達(dá) 1.3kgN/(m3?d)并穩(wěn)定運(yùn)行.

圖1 Anammox-UASB裝置示意Fig.1 Schematic diagram of the Anammox-UASB reactor

實(shí)驗(yàn)采用人工配制進(jìn)水,配水成分為:KHCO31250mg/L,KH2PO427.2mg/L,MgCL2·6H2O 165mg/L,CaCl2·2H2O 250mg/L,微量元素Ⅰ 1mL/L,微量元素Ⅱ 2mL/L,NH4+-N和NO2--N分別以NH4Cl、NaNO2按需提供,SO42-由 Na2SO4提供,投加濃度為342.3mg/L.各階段主要進(jìn)水基質(zhì)如表 1所示.利用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值為(7.5±0.2),水力停留時(shí)間(HRT)為20h.

表1 各階段主要進(jìn)水基質(zhì)Table 1 Components of influent

1.2 批式實(shí)驗(yàn)裝置及運(yùn)行條件

據(jù)實(shí)驗(yàn)需求,在反應(yīng)器的不同階段,從反應(yīng)器中分別取10mL泥水混合物倒入50mL離心管,用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌2～3次,然后將清洗后的污泥和120mL配制好的基質(zhì)(基質(zhì)提前曝高純氮?dú)獬?0min),倒入總?cè)莘e為 130mL的血清瓶,后利用高純氮?dú)鈱?duì)血清瓶中泥水進(jìn)行除氧5min,將其密閉后置于恒溫振蕩器(150r/min,35℃)進(jìn)行反應(yīng).在驗(yàn)證Fe3+與氨氮超量去除的關(guān)系時(shí),主要基質(zhì)為NH4+,取樣間隔為 12h;驗(yàn)證內(nèi)碳源反硝化與氨氮超量去除的關(guān)系時(shí),主要基質(zhì)為 NH4+和 NO3-,每隔 24h取一次樣;驗(yàn)證DO與氨氮超量去除的關(guān)系時(shí),主要基質(zhì)為 NH4+,每隔 24h取一次樣.其他配水元素與反應(yīng)器進(jìn)水相同.

為提高實(shí)驗(yàn)代表性,批式實(shí)驗(yàn)均設(shè) 3組平行.為保證血清瓶?jī)?nèi)厭氧環(huán)境,每次用注滿氮?dú)獾淖⑸淦魅?且平行組取樣體積保持一致.取樣后用0.22μm有機(jī)濾頭過(guò)濾后測(cè)定相關(guān)指標(biāo).

1.3 分析方法

常規(guī)指標(biāo)的測(cè)試方法參考《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》[12]:pH值采用PHS-3S型pH計(jì)測(cè)定;DO采用MO128-2M型便攜式溶解氧儀測(cè)定;硝酸鹽氮采用紫外分光光度法和離子色譜法;亞硝酸鹽氮采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法;氨氮采用納氏試劑分光光度法;硫酸鹽采用 ICS1100離子色譜儀;總鐵采用火焰原子吸收法.

污泥微生物群落結(jié)構(gòu)分析采用基于 Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)的細(xì)菌16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù).測(cè)序流程包括微生物總DNA 提取、目標(biāo)片段 PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化、擴(kuò)增產(chǎn)物熒光定量、MiSeq文庫(kù)構(gòu)建和MiSeq測(cè)序[13-14].其中PCR 擴(kuò)增采用的引物為Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3-V4通用引物341F(5’-CCTACGGGNGGCWG-CAG-3’)和 805R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’).Miseq 測(cè)序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接,同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾,區(qū)分樣本后進(jìn)行OUT聚類(lèi)分析和物種分類(lèi)學(xué)分析.以上工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同亞硝氮濃度供給條件下Anammox反應(yīng)器運(yùn)行特性

2.1.1 氨氮、亞硝氮及硝氮變化規(guī)律 階段Ⅰ～Ⅰ逐步減小 R(降低進(jìn)水亞硝氮濃度)條件下,反應(yīng)器氨氮、亞硝氮及硝氮變化情況如圖2所示.階段Ⅰ投加NH4+-N為200mg/L,R為3:4,氨氮平均去除率為81%,亞硝氮去除率始終接近 100%,硝氮平均產(chǎn)生量為30.8mg/L.階段Ⅱ保持 NH4+-N濃度不變,調(diào)整 R為1:2,此時(shí)氨氮平均去除率為 74.2%,亞硝氮依然沒(méi)有剩余,硝氮平均產(chǎn)生量為 17.7mg/L.階段Ⅲ繼續(xù)減小R為1:4,氨氮平均去除率為45.2%,出水檢測(cè)到極少量亞硝氮,硝氮平均產(chǎn)生量為6.6mg/L.階段Ⅰ對(duì)反、應(yīng)器停供亞硝氮,R=0,連續(xù)運(yùn)行了 45d,停供亞硝氮后氨氮仍有去除,平均去除率為 22.5%,出水監(jiān)測(cè)到少量的亞硝氮,無(wú)硝氮產(chǎn)生.從階段Ⅰ至階段Ⅰ,隨進(jìn)水NO2-濃度的降低,氨氮去除率由81%降至22.5%.因?yàn)檩^低濃度的亞硝氮不會(huì)對(duì)Anammox系統(tǒng)造成毒性抑制,故氨氮去除率降低是由于電子受體的減少.Jetten等[15]指出厭氧氨氧化過(guò)程中產(chǎn)生少量的硝氮,因此,硝氮的產(chǎn)量在一定程度上反映了反應(yīng)器內(nèi)厭氧氨氧化反應(yīng)的情況.隨進(jìn)水 NO2-濃度的降低,硝氮產(chǎn)量從 30.8mg/L最后降至 0,說(shuō)明厭氧氨氧化反應(yīng)越來(lái)越弱.

2.1.2 Anammox反應(yīng)化學(xué)計(jì)量比及 pH值變化規(guī)律 反應(yīng)器中 ΔNH4+-N/ΔNO2--N,ΔNH4+-N/ΔNO3--N值對(duì)系統(tǒng)中厭氧氨氧化反應(yīng)以及其它反應(yīng)可能性的程度具有指導(dǎo)意義.逐步降低進(jìn)水亞硝氮濃度條件下,如圖 3(a)所示,當(dāng) R 為 3:4 時(shí),ΔNO2--N/ΔNH4+-N平均比值為0.96;當(dāng)R為1:2時(shí),ΔNO2--N/ΔNH4+-N平均比值為 0.76;當(dāng) R為 1:4時(shí),ΔNO2--N/ΔNH4+-N平均比值為 0.58.可見(jiàn) ΔNO2--N/ΔNH4+-N 均小于厭氧氨氧化理論值1.32,說(shuō)明氨氮實(shí)際去除量大于厭氧氨氧化反應(yīng)理論去除量,即存在氨氮超量去除現(xiàn)象[7,16-17].圖 2(c)顯示了硝態(tài)氮實(shí)際產(chǎn)生量與理論產(chǎn)生量之間的差異,階段Ⅰ到階段Ⅲ,硝態(tài)氮實(shí)際產(chǎn)量平均值分別為 30.77,17.7,6.62mg/L,而根據(jù)厭氧氨氧化反應(yīng)理論比值衡算硝態(tài)氮理論產(chǎn)量平均值分別為32.26,20.7,10.48mg/L,可見(jiàn)硝態(tài)氮實(shí)際產(chǎn)生量均小于理論產(chǎn)生量.此外,由圖 3(a)可知,從階段Ⅰ到Ⅲ,ΔNO3--N/ ΔNH4+-N 平均值分別為0.18、0.13、0.07,隨 R的降低而減小,且均小于厭氧氨氧化理論值0.26.造成這種現(xiàn)象的原因除了氨氮超量去除,還有另一種可能是厭氧氨氧化生成的硝態(tài)氮被部分消耗,這與硝態(tài)氮實(shí)際產(chǎn)量總是小于理論產(chǎn)量相吻合,說(shuō)明反應(yīng)器內(nèi)存在某種消耗硝態(tài)氮的反應(yīng).

圖2 限NO2-厭氧氨氧化反應(yīng)器運(yùn)行狀況Fig.2 Performance of Anammox reactor with less nitrite

降低進(jìn)水亞硝氮濃度過(guò)程中,反應(yīng)器進(jìn)出水 pH值變化如圖3(b)所示.階段Ⅰ初始,反應(yīng)器出水pH值高于進(jìn)水,從階段Ⅰ末至階段Ⅰ,出水 pH 值均低于進(jìn)水.單純厭氧氨氧化反應(yīng)是一個(gè)產(chǎn)堿的過(guò)程,而反應(yīng)器出水pH值低于進(jìn)水,可以判斷氨氮超量去除途徑是一個(gè)pH值降低的過(guò)程.

圖3 限NO2-厭氧氨氧化反應(yīng)器ΔNO2--N/ΔNH4+-N,ΔNO3--N/ΔNH4+-N和進(jìn)出水pH值變化Fig.3 ΔNO2--N/ΔNH4+-N,ΔNO3--N/ΔNH4+-N variation and pH value of Anammox reactor with less nitrite

2.2 氨氮超量去除的可能途徑

有研究在逐漸提高進(jìn)水氨氮濃度且體系中始終供給亞硝氮條件下,出現(xiàn)的氨氮超量去除,認(rèn)為氨氮過(guò)量供給使得 Anammox反應(yīng)化學(xué)平衡向生成N2H4的方向移動(dòng),表現(xiàn)為Anammox體系對(duì)氨氮的額外吸納現(xiàn)象[11].而本研究中始終保持進(jìn)水氨氮濃度一定、逐漸降低進(jìn)水亞硝氮濃度直至停供亞硝氮,難以利用該化學(xué)平衡說(shuō)來(lái)解釋氨氮的超量去除現(xiàn)象.

無(wú)機(jī)條件下,AnAOB除了利用最佳電子受體亞硝氮外,還會(huì)以SO42-為電子受體進(jìn)行反應(yīng)[18-19].但是本反應(yīng)器長(zhǎng)期投加 SO42-,并沒(méi)有 SO42-去除現(xiàn)象(圖4),這與劉福鑫[20]研究類(lèi)似.因此,本研究中 NH4+的超量去除與 SO42-沒(méi)有明顯關(guān)系.Bi[10]通過(guò)對(duì) NH4+和SO42-同時(shí)去除的轉(zhuǎn)化途徑研究認(rèn)為Anammox過(guò)程不會(huì)以 SO42-為電子受體氧化氨,而是兩者各自獨(dú)立轉(zhuǎn)化.

圖4 反應(yīng)器進(jìn)出水硫酸鹽濃度Fig.4 SO42- concentrations in effluent and influent

由于本反應(yīng)器進(jìn)水未采取除氧措施,故進(jìn)水中向系統(tǒng)中引入少量的 DO(進(jìn)水 DO約 8mg/L),為了驗(yàn)證進(jìn)水 DO對(duì)氨氮超量去除的影響,保持其它條件不變,從 85d開(kāi)始對(duì)反應(yīng)器進(jìn)水進(jìn)行曝氮?dú)獬?使DO降至2mg/L以下,并將進(jìn)水桶密封防止進(jìn)水復(fù)氧,連續(xù) 10d對(duì)進(jìn)水除氧發(fā)現(xiàn)氨氮去除量并未發(fā)生明顯變化,這與嚴(yán)鋒[21]研究結(jié)果相同.經(jīng)計(jì)算 6mg/L的DO僅能氧化1.75mg/L的NH4+-N,因此,進(jìn)水中DO遠(yuǎn)不足以去除如此多的氨氮.故必然存在其他的電子受體參與氨氮的超量去除.

2.3 氨氮超量去除的轉(zhuǎn)化方式

2.3.1 Fe3+與氨氮超量去除關(guān)系 研究表明,亞硝氮缺乏時(shí),Fe3+可以作為電子受體被 AnAOB利用[22-23],由于微生物自身細(xì)胞含有 0.02%的鐵元素[24].從反應(yīng)器取適量污泥測(cè)定總鐵,發(fā)現(xiàn)污泥中的鐵含量(0.43mg/gVSS)不足以引起氨氮的超量去除.并且研究發(fā)現(xiàn)AnAOB體內(nèi)的鐵對(duì)其氮代謝途徑無(wú)顯著影響[25-26].由于配水中加入的微量元素Ⅰ也含有鐵鹽,推測(cè)此類(lèi)物質(zhì)參與了氨氮的超量氧化.故設(shè)計(jì)批式實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證配水中微量元素Ⅰ中Fe3+是否參與了氨氮的超量氧化.

研究認(rèn)為[27]Fe3+投加量為 0.08mmol/L時(shí),反應(yīng)器氮去除性能最好,而本研究微量元素Ⅰ中 Fe3+濃度為 0.02mmol/L.因此設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn),確定 B組加4.48mL/L微量元素Ⅰ,A組不加微量元素Ⅰ,兩組實(shí)驗(yàn)主要基質(zhì)為氨氮.由圖 5可知,前 24h,A組氨氮從44.4mg/L降至 37.7mg/L,B組從 45.2mg/L降至34.8mg/L,在12h監(jiān)測(cè)到A、B兩組亞硝氮積累量分別為0.02,0.05mg/L,硝氮積累量分別為2.5, 1.6mg/L.24h至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,A、B組氨氮含量均未發(fā)生下降,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)得 A、B組氨氮濃度分別為 35.4和34.6mg/L.雖然B組下降較快,但與A組相比,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí) B組沒(méi)有去除更多的氨氮,說(shuō)明本研究中氨氮的超量去除與鐵沒(méi)有明顯相關(guān)關(guān)系.研究報(bào)道[28-29]在厭氧環(huán)境下 Fe3+還原氨氧化的現(xiàn)象,而本研究未發(fā)現(xiàn) Fe3+參與氨氮的氧化現(xiàn)象,可能是由于實(shí)驗(yàn)條件的不同,有待于進(jìn)一步研究.

圖5 Fe3+與氨氮超量去除關(guān)系Fig.5 The relationship between Fe3+ and excess removal of ammonium

2.3.2 內(nèi)碳源反硝化以及與氨氮超量去除之間的關(guān)系 對(duì)于反應(yīng)器中可能存在消耗硝酸鹽的反應(yīng)的問(wèn)題,設(shè)計(jì)批式實(shí)驗(yàn)探究反應(yīng)器中是否存在內(nèi)碳源反硝化.如圖 6(a)所示,經(jīng) 48h反應(yīng),硝酸鹽濃度從39.6mg/L降至 34.3mg/L,同時(shí)檢測(cè)到2.8mg/L亞硝氮,pH值從7.51升至7.81.

早有 Graaf[30]發(fā)現(xiàn)硝酸鹽作為間接電子受體與氨氮同步去除.由圖 6(b)可知,氨氮和硝氮均勻下降,氨氮由71.25mg/L降至38.77mg/L,硝氮由54.17mg/L降至 11.13mg/L,整個(gè)過(guò)程未監(jiān)測(cè)到亞硝氮,實(shí)驗(yàn)結(jié)束體系pH值為8.2,高于初始pH值.

圖6 內(nèi)碳源反硝化與氨氮超量去除之間的關(guān)系Fig.6 The relationship between endogenous denitrification and excess removal of ammonium

Waki等[31]認(rèn)為AnAOB不能直接以NH4+-N和NO3--N作為電子供受體,要使其順利進(jìn)行,需要在其他電子供體存在的條件下將NO3--N還原為NO2--N后,進(jìn)行緩慢的 Anammox反應(yīng).該批式實(shí)驗(yàn)中氨氮與硝酸鹽同步去除,這是由于Anammox反應(yīng)器內(nèi)存在少量的反硝化菌[32],無(wú)機(jī)條件下,異養(yǎng)反硝化菌會(huì)利用有限的內(nèi)碳源將Anammox過(guò)程產(chǎn)生的硝酸鹽部分還原為亞硝酸鹽[33],從而與氨氮發(fā)生Anammox反應(yīng).亞硝酸鹽是 Anammox最適合的電子受體,能夠與氨氮在短暫的時(shí)間內(nèi)完全反應(yīng)[34],這為系統(tǒng)中未監(jiān)測(cè)到亞硝氮提供了依據(jù).由于缺乏碳源,硝酸鹽還原為亞硝酸鹽過(guò)程緩慢,內(nèi)碳源反硝化過(guò)程為氨氮的超量去除提供了一種理論依據(jù).

2.3.3 氨氮超量去除的限制性因素 為了進(jìn)一步探究氨氮超量去除的原因,只投加氨氮進(jìn)行批式實(shí)驗(yàn).如圖 7所示,初始氨氮濃度為 48.21mg/L,前 24h氨氮降低了13.62mg/L,有少量的亞硝氮和硝氮產(chǎn)生,24～72h氨氮濃度穩(wěn)定在 35.17mg/L左右,未監(jiān)測(cè)到亞硝氮和硝氮.72h時(shí)向系統(tǒng)注入約10mL空氣,96h氨氮濃度為 20.24mg/L,同時(shí)檢測(cè)到 4.03mg/L的亞硝氮和2.24mg/L的硝氮,pH值從7.6降至7.29.

圖7 溶解氧與氨氮超量去除的關(guān)系Fig.7 The relationship between dissolved oxygen and excess removal of ammonium

前 24h,氨氮濃度下降,緊接著又保持不變,說(shuō)明反應(yīng)體系中某種物質(zhì)含量有限.而向系統(tǒng)注入空氣后發(fā)現(xiàn)氨氮濃度迅速降低,足以說(shuō)明氨氮的去除與DO有關(guān),認(rèn)為Anammox體系中存在AOB參與了氨氮的超量去除.將 DO 和氮去除之間關(guān)系衡算,系統(tǒng)總氮損失量為 0.61mmol/L,假定總氮都通過(guò)厭氧氨氧化方式去除,通過(guò)式(1)計(jì)算得所需的氨氮、亞硝氮及通過(guò)該步驟產(chǎn)生的硝氮含量分別為 0.3,0.39,0.08mmol/L;假定Anammox所需的亞硝氮和反應(yīng)體系剩余的亞硝氮均由亞硝化所得,通過(guò)式(2)計(jì)算出該亞硝化過(guò)程所需氧氣的量為 1.02mmol/L;根據(jù)反應(yīng)體系共產(chǎn)生硝氮的量,得知 0.083mmol/L的硝氮由硝化過(guò)程產(chǎn)生,通過(guò)式(3)可得該過(guò)程所需氧氣量為0.17mmol/L.故實(shí)驗(yàn)共需氧氣量為1.19mmol/L,通過(guò)血清瓶中剩余溶液體積(以 80mL計(jì))換算得3.04mg的氧氣,再根據(jù)氧氣質(zhì)量分?jǐn)?shù)及實(shí)驗(yàn)溫度下空氣密度(25℃.1.184mg/mL)計(jì)算出實(shí)驗(yàn)所需空氣量為 11.15mL,接近于注入的 10mL空氣.因此,該批式實(shí)驗(yàn)中氨氮是通過(guò)AOB和AnAOB共同去除的.

前文已經(jīng)證實(shí)反應(yīng)器進(jìn)水中DO的量不足以去除反應(yīng)器中氨氮超量去除的量,但批式實(shí)驗(yàn)說(shuō)明氨氮的去除必與氧氣有關(guān),故存在其它 DO滲入反應(yīng)器的途徑.UASB回流過(guò)程會(huì)把部分帶有DO的出水重新帶到反應(yīng)器底部,同時(shí)回流過(guò)程會(huì)造成三相分離器空間變化引起內(nèi)外氣壓差,使得外界空氣更容易進(jìn)入反應(yīng)器[35].

除了以上原因,還有報(bào)道稱(chēng)[36-37]微生物代謝過(guò)程能夠產(chǎn)生活性氧類(lèi)物質(zhì),形成超氧自由基(O2-)和羥基自由基(OH?),在缺乏亞硝氮的Anammox反應(yīng)器中,微生物抑制或腐爛過(guò)程同樣釋放出 OH?等氧化劑,這些自由基也是氨氮超量氧化的潛在電子受體來(lái)源[38].甚至有研究[20]認(rèn)為亞硝氮缺乏時(shí),HCO3-作為電子受體氧化了氨氮,NH4+和 HCO3-之間發(fā)生的是生物反應(yīng).但這些報(bào)道只是理論推測(cè),還需進(jìn)一步研究.

2.4 污泥微生物菌群解析

反應(yīng)器中氮素的脫除是微生物作用的結(jié)果,通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)的解析能夠更進(jìn)一步對(duì)氨氮去除的代謝途徑進(jìn)行預(yù)測(cè)分析.分別在 R為3:4運(yùn)行末期和停供亞硝氮后運(yùn)行45d從反應(yīng)器取2個(gè)污泥樣品,分別記為A2、A4,進(jìn)行高通量測(cè)序.如表2所示,兩個(gè)樣本的Coverage指數(shù)均為 100%,說(shuō)明測(cè)序結(jié)果足夠代表樣本中的微生物群落組成.ACE和Chao指數(shù)[39]均有所增大,說(shuō)明從進(jìn)水供少量亞硝氮階段到停供亞硝氮階段,物種總數(shù)在增多.Simpson指數(shù)越大,說(shuō)明優(yōu)勢(shì)菌群占總體生物菌群比例越大[40];Shannon[41-42]指數(shù)越高,群落復(fù)雜程度越大.停供亞硝氮后微生物多樣性在增加,說(shuō)明停供亞硝氮后氨氮的去除需要更多類(lèi)型的微生物共同完成.

表2 污泥樣品Alpha多樣性Table 2 Alpha diversity of the two samples

利用高通量測(cè)序技術(shù)分別考察了反應(yīng)器 R為3:4和停供亞硝氮兩個(gè)階段污泥在屬水平上的微生物菌群結(jié)構(gòu),如圖8所示,在限亞硝氮和停供亞硝氮2個(gè)階段微生物群落中,厭氧氨氧化菌、好氧氨氧化菌、反硝化菌和亞硝酸鹽氧化菌同時(shí)存在.Anammox體系中停供亞硝氮前后亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)相對(duì)豐度從 3.29%增長(zhǎng)到 7.3%,雖然Anammox體系為厭氧環(huán)境,但Nitrosomonas被認(rèn)為是需氧氧化銨[43],說(shuō)明反應(yīng)器內(nèi)部確實(shí)存在外界氧氣滲入的可能,這與2.3.3討論相吻合.檢測(cè)到的反硝化菌屬主要為Ignavibacterium,其相對(duì)豐度由0.54%增加到 3.14%, Ignavibacterium能夠利用細(xì)菌衰老和死亡的細(xì)胞產(chǎn)物進(jìn)行厭氧發(fā)酵和反硝化作用[44].

圖8 NO2--N/NH4+-N為3:4和停供亞硝氮2階段主要脫氮細(xì)菌(屬)組成變化Fig.8 Microbial community for nitrogen removal in the reactor NO2--N/NH4+-N is 3:4 and after no feeding of nitrite

停供亞硝氮后Candidatus_Brocadiaceae屬有所增長(zhǎng),相對(duì)豐度由 7.67%增長(zhǎng)到 10.83%,而Candidatus_Jettenia屬無(wú)明顯變化,這是由于氨氧化菌將部分氨氮氧化為亞硝氮,反硝化菌將部分硝酸鹽還原為亞硝氮,為AnAOB供應(yīng)了極少量的亞硝氮,說(shuō)明Candidatus_Brocadiaceae能夠適應(yīng)極低亞硝氮環(huán)境并生長(zhǎng)繁殖,Candidatus_Jettenia也能夠在此環(huán)境中生存.反應(yīng)器從 R為 3:4到停供亞硝氮階段,Armatimonadetes_gp5相對(duì)豐度由 20.7%增長(zhǎng)到24.6%,Mi等[45]認(rèn)為Armatimonadetes_gp5是一種適合在低氨氮濃度下生存的新型厭氧氨氧化菌.兩個(gè)污泥樣品中還檢測(cè)到極少量的亞硝酸鹽氧化菌屬(Nitrospira),約占總細(xì)菌的0.1%,Nitrospira未增長(zhǎng)說(shuō)明不適合在該環(huán)境中生長(zhǎng).

不管是反應(yīng)器R為3:4還是停供亞硝氮,超量去除的這部分氨氮均由氨氧化菌、厭氧氨氧化菌和反硝化菌共同完成.主要有兩種途徑:一是在微量 DO的作用下,氨氧化菌將部分氨氮氧化為亞硝氮,AnAOB再將該部分亞硝氮與剩余的氨氮去除;二是Anammox產(chǎn)生的硝氮有一部分被反硝化菌經(jīng)內(nèi)碳源反硝化作用還原為亞硝氮,該部分亞硝氮與體系中其余的氨氮也通過(guò)Anammox作用去除.

2.5 反應(yīng)器中氨氮超量去除量變化規(guī)律

由圖9可知,從階段Ⅰ到階段Ⅰ,當(dāng)R為3:4時(shí),超量去除氨氮量均值為45.5mg/L;當(dāng)R為1:2時(shí),均值為 57.2mg/L;而當(dāng) R為 1:4時(shí),其均值為 52mg/L;當(dāng)R為0時(shí),均值為45.5mg/L.可見(jiàn),當(dāng)R從3:4減小為1:2時(shí),超量去除氨氮的量有所增加;而當(dāng)R從1:2降至 0時(shí),超量去除氨氮的量緩慢減少;當(dāng) R為 1:2時(shí),超量去除氨氮的量最大.

圖9 限NO2-厭氧氨氧化反應(yīng)器氨氮超量去除量Fig.9 Excess removal of ammonium in the Anammox reactor with less nitrite

由前文可知,氨氧化菌在氨氮超量去除中起著關(guān)鍵的作用.階段Ⅰ(R為 3:4)進(jìn)水亞硝氮濃度為150mg/L,污泥層的亞硝酸鹽濃度較高可能會(huì)對(duì)氨氧化菌活性造成抑制,氨氧化速率較低,使得氨氮超量去除量較低.而R小于1:2時(shí),反應(yīng)器中厭氧氨氧化菌可利用的基質(zhì)已相對(duì)較少,反應(yīng)器中氮的去除主要由氨氧化協(xié)同厭氧氨氧化菌完成,由于Anammox過(guò)程產(chǎn)生的堿度已相對(duì)較少,體系中 pH值下降較多(圖 3b).并且,通過(guò)數(shù)據(jù)核算了各階段穩(wěn)定后硝酸鹽實(shí)際生成量與理論生成量的差值(圖 2c),在 R等于3:4(17～27d穩(wěn)定)時(shí)為1mg/L,在R等于1:2時(shí)(39～50d穩(wěn)定)為 6.7mg/L,在 R等于 1:4時(shí)(65～75d穩(wěn)定)為2.7mg/L,而在不投加亞硝酸鹽后,以亞硝酸鹽計(jì)的硝酸鹽生成量降低為0.可推測(cè)反硝化菌在各階段所起作用的程度大小,在R等于1:2時(shí)硝酸鹽實(shí)際生成量與理論生成量的差值最大.所以本文在R等于1:2時(shí)氨氮超量去除量達(dá)最大.

3 結(jié)論

3.1 當(dāng) Anammox體系中進(jìn)水 R(NO2--N/NH4+-N)由理論比值1.32減小為1:2時(shí),氨氮超量去除量增加;而當(dāng)R由1:2減小至1:4時(shí),氨氮超量去除量保持穩(wěn)定.當(dāng)R為1:2時(shí),氨氮超量去除量最大,為57.2mg/L.批式實(shí)驗(yàn)證明溶解氧是氨氮超量去除量的限制性因素.

3.2 當(dāng) Anammox體系長(zhǎng)期停供亞硝氮時(shí),氨氮依然得以脫除且 SO42-并未去除,無(wú)證據(jù)表明本Anammox體系能夠利用硫酸鹽為電子受體氧化氨氮.此外,停供亞硝氮后 Anammox體系中微生物群落多樣性有所增加,AnAOB、氨氧化菌(Nitrosomonas)和反硝化菌(Ignavibacterium)相對(duì)豐度均增加,氨氧化菌在微量 DO作用下將部分氨氮氧化為亞硝氮,AnAOB將與之協(xié)同實(shí)現(xiàn)氮的去除.Candidatus Jettenia屬和Candidatus Brocadia屬都能夠在亞硝氮缺失的條件下進(jìn)行氮的脫除.

3.3 本Anammox體系中氨氮超量去除的途徑包括好氧氨氧化、Anammox與部分異養(yǎng)反硝化.參與上述生化反應(yīng)的微生物有氨氧化菌、厭氧氨氧化菌和反硝化菌.