葡聚糖分子質(zhì)量對其與牛血清白蛋白共聚物性質(zhì)的影響

張曉燕,孟令莉,吳子健*,劉丹丹,趙穎濤

1(天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津,300134) 2(天津商業(yè)大學(xué) 藝術(shù)學(xué)院,天津,300134)

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)是一種血漿蛋白,具有維持滲透壓、可作為載體等作用[1]。特別是其傳遞營養(yǎng)物質(zhì)的作用,近年來受到廣泛關(guān)注。但受到其自身結(jié)構(gòu)性能(如乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性等)的影響,由其制備成的載體不穩(wěn)定,易發(fā)生相分離[2]。而研究改性的BSA,對于改善其功能性質(zhì),開發(fā)新的應(yīng)用途徑有著非常重要的意義。

目前,研究發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)能夠改善蛋白質(zhì)的功能特性,且由多糖-蛋白形成的共聚物制備的乳濁液穩(wěn)定性良好[3]。美拉德反應(yīng)是糖分子中還原末端羰基與蛋白質(zhì)分子中的氨基酸殘基側(cè)鏈上的ε-氨基進(jìn)行的接枝反應(yīng),是一種綠色、安全、無污染的蛋白質(zhì)改性方法[4]。通過美拉德反應(yīng)接枝多糖后的蛋白質(zhì)在pH穩(wěn)定性、乳化性、起泡性和熱穩(wěn)定性等方面都有明顯改善[5-7]。改性后的蛋白質(zhì)不僅可以應(yīng)用于食品的功能成分、添加劑,還可以對不穩(wěn)定的生物活性進(jìn)行包埋和運(yùn)輸[8-9]。MENGIBAR等[10]發(fā)現(xiàn)乳球蛋白-殼聚糖美拉德共聚物可提高乳液體系的氧化穩(wěn)定性和物理穩(wěn)定性；YANG等[11]研究表明大豆蛋白-多糖共聚物可提高整個(gè)乳液體系的儲(chǔ)存穩(wěn)定性；CHENG等[12]研究得出葡聚糖(dextran,DEX)的接枝可提高大米蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性；WANG等[13]的研究表明BSA-DEX共聚物包埋姜黃素可改善其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性及抗氧化活性。由此可見,接枝反應(yīng)改性的蛋白已經(jīng)在食品中的揮發(fā)性成分(包括精油)、辛香料及生物活性物質(zhì)的包埋中發(fā)揮舉足輕重的作用[14]。但是,DEX的分子質(zhì)量對于接枝產(chǎn)物的性質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生影響。

目前,對于多糖分子質(zhì)量是否會(huì)影響其共聚物的理化性質(zhì)及穩(wěn)定性鮮有報(bào)道,這就使得改性糖蛋白的應(yīng)用受到環(huán)境、條件和應(yīng)用領(lǐng)域的制約。本研究通過BSA-DEX共聚物中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)，乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡及泡沫穩(wěn)定性等方面的測定,分析DEX分子質(zhì)量對BSA-DEX共聚物理化性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛血清白蛋白Ⅴ(分子質(zhì)量68 kDa),Solarbio公司；4種葡聚糖(分子質(zhì)量分別為1 k、5 k、70 k、100 kDa),MACKLIN公司；三羥甲基氨基甲烷,中奧天元公司；考馬斯亮藍(lán)R-250,Beyotime公司；1-苯胺基-8苯磺酸(1-anilino-8-napthalene sulfonic acid,ANS),Sigma Aldrich公司；鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)、SDS,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

FD-5N型真空冷凍干燥機(jī),日本EYELA公司；紫外可見分光光度計(jì)、Seven Excellence pH計(jì),瑞士METTLER公司；T10basic ULTRA-TURRAX小型分散機(jī),德國IKA公司；SE 260型垂直電泳系統(tǒng),美國Hoefer公司；NanoPhotometer-N50型超微量紫外分光光度計(jì),德國IMPLEN公司；Essential V6型凝膠成像系統(tǒng),英國uvitec公司；FL970熒光分光光度計(jì),香港Techcomp公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BSA-DEX共聚物的制備

參考TU等[15]的方法并做調(diào)整：將DEX與BSA以1∶1的質(zhì)量比溶解在PBS中(0.01 mol/L,pH 7.0),調(diào)節(jié)蛋白溶液的最終質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL,室溫下攪拌至完全溶解,凍干,凍干的樣品密封后置于溫度60 ℃,濕度79%的密閉環(huán)境中反應(yīng)24 h。設(shè)置參數(shù)為:對照組BSA為未添加DEX；BSA與分子質(zhì)量分別為1 k、5 k、70 k、100 kDa的DEX所得共聚物分別命名為BDC 1、BDC 5、BDC 70和BDC 100。

1.2.2 SDS-PAGE

參照FAN等[16]的方法。分離膠10%、濃縮膠4%、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度5 mg/mL,上樣量7.0 μL,電壓200 V、電泳時(shí)間50 min左右。

1.2.3 傅里葉紅外光譜

傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)參照 ZHAO 等[17]的方法。稱取適量樣品[m(樣品)∶m(溴化鉀)=1∶100],研磨成均勻的粉末并壓成薄片,用傅里葉變換紅外譜儀作全波段(4 000～400 cm-1)掃描,掃描16次,掃描前用溴化鉀薄片扣除背景。

1.2.4 接枝度的測定

參考FENG等[18]的方法。準(zhǔn)確稱取40.00 mg的OPA,溶解在1.0 mL的甲醇中,然后依次加入2.5 mL的SDS(20%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)),25 mL的四硼酸鈉(0.1 mol/L),100 μL的β-巰基乙醇,最后用蒸餾水定容至50 mL。測定樣品時(shí),取4.0 mL的OPA溶液,加200 μL的樣品混合均勻,置于35 ℃的水浴中反應(yīng)2 min,在波長340 nm下測吸光度值A(chǔ)?？瞻讓φ占尤?00 μL蒸餾水代替樣品。按照上述方法用賴氨酸代替樣品繪制賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)該曲線,計(jì)算樣品中游離氨基的含量,并根據(jù)公式(1)測定樣品的接枝度：

(1)

式中:c0,接枝反應(yīng)前溶液中自由氨基的濃度,mol/L；c1,接枝反應(yīng)后溶液中自由氨基的濃度,mol/L。

1.2.5 表面疏水性的測定

參考XUE等[19]的方法,20.0 μL ANS溶液(8 mmol/L)和5.0 mL不同質(zhì)量濃度蛋白溶液(0.01～0.05 mg/mL)均勻混合,在室溫下反應(yīng)1.0 min后,測定其熒光強(qiáng)度。測定條件：激發(fā)波長(EX)和發(fā)射波長(EM)分別為280和490 nm,以上述不同濃度的蛋白溶液(0.01～0.05 mg/mL)為空白。以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖,直線斜率即是蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)。

1.2.6 熒光光譜的測定

按照YAN等[20]的方法測定樣品的內(nèi)源性熒光。調(diào)節(jié)蛋白終質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL,激發(fā)波長280 nm,掃描波段310～450 nm,狹縫寬度5 nm,掃描速率2 400 nm/min。

1.2.7 美拉德反應(yīng)褐變程度的測定

褐變程度的測定參照DJELLOULI等[21]的方法。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)量濃度為5.00 mg/mL,以不加蛋白樣品的PBS為空白樣,在420 nm下測定吸光度值,即表示共聚物蛋白的褐變程度。

1.2.8 色差的測定

采用SANMARTIN等[22]的方法,稍作調(diào)整。采用色差儀對樣品的色澤進(jìn)行測定,顏色參數(shù)L*、a*、b*值分別表示亮度值、黃綠值和紅藍(lán)值。

1.2.9 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

蛋白的乳化活性(emulsion activity index,EAI)和乳化穩(wěn)定性(emulsion stability index,ESI)的測定分別參照崔珊珊[23]和CHEN[24]的方法測定。配制蛋白溶液至終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL,并以體積比3∶1加入玉米胚油,用均質(zhì)頭均質(zhì)(轉(zhuǎn)速16 000 r/min)1 min后,立即從底部抽取100 μL溶液,并加入5.0 mL SDS溶液(0.1%、pH 7.0),混合后再混合均勻,測定500 nm波長下的吸光度記為A0,20 min后,重復(fù)之前操作,測定吸光度,記為A20。乳化性和乳化穩(wěn)定性計(jì)算分別如公式(2)(3)所示：

(2)

(3)

式中：φ,油相體積分?jǐn)?shù)(油的體積/乳化體系的體積,1/3)；ρ,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,g/L；A0和A20為乳化體系分別在0、20 min時(shí)的吸光度；N為稀釋倍數(shù),此處的稀釋倍數(shù)為50。

1.2.10 起泡性與泡沫穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定參照付本寧[25]的方法測定。統(tǒng)一調(diào)節(jié)共聚物蛋白質(zhì)溶液的終質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL,記錄起始溶液體積為V0,在均質(zhì)機(jī)中,以10 000 r/min均質(zhì)2 min,測量蛋白質(zhì)溶液和泡沫的總體積,計(jì)為V1,30 min后,再次測量蛋白溶液和泡沫的總體積,計(jì)為V2。

起泡性、泡沫穩(wěn)定性計(jì)算分別如公式(4)和公式(5)所示：

(4)

(5)

式中：h0,初始時(shí)的液面高度,cm；h1,均質(zhì)后的液面高度,cm；h2,靜置30 min后的液面高度,cm。

1.2.11 流變性的測定

根據(jù)FILONZI等[26]的方法,檢測參數(shù)：溫度25 ℃,cp50錐板,樣品板與測試板之間的距離0.8 mm,剪切速率掃描范圍0～100 s-1。操作步驟如下：在測試板上滴入2 mL的乳液,保證頂板與樣品液接觸,擦去平板周圍多余的溶液,啟動(dòng)程序,采集數(shù)據(jù)。

1.2.12 統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每次實(shí)驗(yàn)測定3個(gè)平行樣,數(shù)據(jù)作圖使用Origin 8.1軟件,顯著性分析使用SPSS 22.0進(jìn)行處理(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE

采用SDS-PAGE 法測定BSA-DEX共聚物的分子質(zhì)量,結(jié)果如圖1所示。BSA的分子質(zhì)量分布于67.2 kDa,與ANTHONY-REGNITZ[27]用電噴霧電離質(zhì)譜測得的結(jié)果(66.4 kDa)相一致；對照 BSA的分子質(zhì)量條帶沒有發(fā)生變化,這說明干熱處理對BSA不產(chǎn)生影響,BSA-DEX共聚物分子質(zhì)量有明顯的增加。BDC 1的條帶顯示原BSA條帶消失,共聚物BDC 1的分子質(zhì)量集中分布在77.4 k～95.1 kDa,沒有較大分子質(zhì)量的共聚蛋白條帶,這可能是因?yàn)? kDa分子質(zhì)量的DEX有較小的空間位阻,更易與BSA發(fā)生反應(yīng),但由于BSA含量較少,不足以與1 kDa的DEX完全發(fā)生反應(yīng)[28]；BDC 5的條帶分布在77.4 k～274.4 kDa,出現(xiàn)微弱的漫散射現(xiàn)象。而BDC 70與BDC 100的分子質(zhì)量分布在68 k～261 kDa,68 kDa處的BSA條帶依舊清晰。

2.2 傅里葉紅外光譜測定

圖2 BSA-DEX共聚物的紅外光譜圖

2.3 接枝度與表面疏水性

如表1所示,不同分子質(zhì)量的DEX都能與BSA發(fā)生接枝反應(yīng),接枝度具有顯著的差異。其中BDC 5的接枝度最大,其次是BDC 1,BDC 70和BDC 100的接枝度依次減少。這是因?yàn)殡S著分子質(zhì)量的增加,空間位阻也會(huì)增加,因此不利于反應(yīng)基團(tuán)的相互接觸,從而抑制了反應(yīng)的進(jìn)行[32]；相反,分子質(zhì)量小,空間位阻降低,BSA更易與其發(fā)生反應(yīng),這時(shí)蛋白質(zhì)的分子量則是影響接枝度的關(guān)鍵。分子質(zhì)量1 kDa的DEX更易與BSA發(fā)生反應(yīng),但由于BSA的量不足以與DEX完全反應(yīng),因此導(dǎo)致接枝度小于BDC 5。

表1 BSA-DEX共聚物的接枝度與表面疏水性

在蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)中,非極性基團(tuán)即疏水基團(tuán)轉(zhuǎn)向分子內(nèi)部形成疏水鍵,極性基團(tuán)即親水基團(tuán)或者轉(zhuǎn)向分子內(nèi)部相互作用形成氫鍵,或者轉(zhuǎn)向分子表面與極性水分子相互作用[33]。由表1中共聚物的表面疏水性可知,BSA發(fā)生接枝反應(yīng)后形成的共聚物表面疏水性發(fā)生不同程度的下降,接枝度越大,下降程度越明顯。當(dāng)BSA與強(qiáng)親水性的DEX發(fā)生接枝反應(yīng)時(shí),蛋白質(zhì)的肽鏈中的親水基團(tuán)增加,蛋白質(zhì)表面的親水性增強(qiáng)；另一方面蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生伸展,使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的極性基團(tuán)暴露,從而疏水性降低[34]。蛋白質(zhì)接入的糖鏈越多,接枝度越大,其親水性越強(qiáng),表面疏水性就越小。

2.4 熒光強(qiáng)度

含芳香族氨基酸殘基(即色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的蛋白質(zhì)在280或295 nm的激發(fā)光下會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性熒光。其中色氨酸的熒光峰位波長位于348 nm,熒光強(qiáng)度也是最大,因而也是研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化的主要的內(nèi)源探針。BSA的一級序列中含有2個(gè)色氨酸殘基：一個(gè)位于疏水區(qū)域,另一個(gè)位于親水區(qū)域的表面[35]。圖3表示 BSA與DEX形成共聚物后的熒光強(qiáng)度,其中BSA的熒光強(qiáng)度最大,BSA與DEX共聚物熒光強(qiáng)度發(fā)生不同程度的降低,BDC 5的熒光強(qiáng)度降低最為明顯,且接枝度越高,熒光強(qiáng)度的降低越明顯。這是因?yàn)榻又Ψ磻?yīng)后,多糖對蛋白質(zhì)本身含有的色氨酸殘基形成掩蔽作用,從而引起了最大熒光強(qiáng)度的降低。SUN等[36]在對卵清蛋白與多糖的接枝反應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)共聚物的熒光強(qiáng)度的降低；趙城彬[33]研究發(fā)現(xiàn)接枝度越大,DEX與玉米醇溶蛋白共聚物的熒光強(qiáng)度降低越明顯。這與本文的研究結(jié)果相對應(yīng)。

圖3 BSA-DEX共聚物的熒光強(qiáng)度

BSA-DEX共聚物的最大熒光強(qiáng)度所對應(yīng)的波長見表2,BSA與 DEX 形成共聚物的λmax相比于BSA都發(fā)生了偏移,其中,BDC 5的偏移現(xiàn)象最為明顯,結(jié)合接枝度結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),BDC 5的接枝度最高。這說明BSA與 DEX發(fā)生接枝反應(yīng)后,會(huì)引起蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。SPOTTI等[37]在乳清蛋白-葡聚糖接枝物的熒光光譜分析中發(fā)現(xiàn),共價(jià)接枝后λmax發(fā)生紅移,接枝度越大,偏移現(xiàn)象越明顯。

表2 BSA-DEX共聚物的最大熒光強(qiáng)度及對應(yīng)的波長

2.5 色差和褐變程度

在接枝反應(yīng)期間,蛋白質(zhì)和多糖會(huì)因?yàn)槊览路磻?yīng)形成褐色復(fù)合物,可通過測定色度分析樣品的色澤變化和褐變程度。由表3可知,與BSA相比,BSA-DEX共聚物的接枝度越高,L*(明暗值)降低越明顯,而a*(紅綠值)和b*(黃藍(lán)值)顯著增加(P<0.05),發(fā)生顯著褐變。其中BDC 5的變化尤為明顯,與接枝度的分析結(jié)果相對應(yīng)。這說明分子質(zhì)量為5 kDa的多糖在與蛋白接枝反應(yīng)中能夠暴露出更多活性羰基,使活性中間產(chǎn)物的含量增加,并與其他活性前體發(fā)生連接和聚合,最后在美拉德反應(yīng)的最終階段形成較多的褐色聚合物[38]。

表3 BSA-DEX共聚物的色差數(shù)據(jù)及褐變程度

2.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性

乳化性是蛋白質(zhì)重要的功能特性之一,對蛋白質(zhì)的加工應(yīng)用具有重要的意義[39]。如圖4所示,BSA-DEX 共聚物的乳化性和乳化穩(wěn)定性較BSA均有顯著增加。其中BDC 5的乳化性最好為(49.06±0.85)m2/g,而乳化穩(wěn)定性較其他共聚物而言較小。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與多糖發(fā)生接枝反應(yīng)后,空間結(jié)構(gòu)變的松散,疏水基團(tuán)暴露,改變了蛋白質(zhì)中親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)之間的平衡,降低蛋白乳液的界面張力,最終使得乳化性升高[40]。BDC乳化性的變化,與接枝度的大小相關(guān),接枝度越大,乳化性越強(qiáng)。

BDC 70和BDC 100的乳化穩(wěn)定性最大,這是因?yàn)槎嗵堑姆肿淤|(zhì)量越大,空間位阻作用越大,穩(wěn)定性就越好。PUGNALONI[34]研究表明,蛋白質(zhì)-多糖接枝物能夠在液滴附近形成混合的多分子層結(jié)構(gòu),從而降低液滴的聚集程度,達(dá)到改善乳化性的目的。

2.7 起泡性與泡沫穩(wěn)定性

圖5為BDC的起泡性與泡沫穩(wěn)定性曲線,接枝后共聚物的起泡性較BSA顯著降低,而泡沫穩(wěn)定性顯著升高。BDC 5的起泡性最低,泡沫穩(wěn)定性最大。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)越疏松,起泡性就越好；相反蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)越緊密,剛性越好,越難變形,則蛋白質(zhì)的起泡性越低[41]。蛋白質(zhì)分子中暴露在表面的疏水性氨基酸數(shù)量也影響著起泡能力。結(jié)合分析可得,干熱法接枝產(chǎn)物雖溶解度有所提高,但其蛋白分子是一類結(jié)構(gòu)緊密、剛性強(qiáng)、難于變形的分子,因而無法迅速吸附在氣-水界面上展開形成有序的蛋白分子層,起泡能力差,其泡沫體積保留量也少。

圖5 BSA-DEX共聚物的起泡性與泡沫穩(wěn)定性

2.8 流變性

如圖7所示,BSA-DEX共聚物的乳液黏度隨著剪切速率的增加而降低,最終達(dá)到平衡,此為典型的牛頓流體特性；隨著 DEX 分子質(zhì)量的增大黏度也在升高。DEX接入BSA后,其本身具有增稠作用,引起了乳液體系黏度的增加,生成了更加穩(wěn)定的共聚物,增強(qiáng)了在乳液體系中的相互作用和抗剪切作用力,從而引起黏度增大[42]。LIU等[43]對核桃乳狀液的研究發(fā)現(xiàn),高黏度乳液能夠阻礙液滴的相互聚集,從而提高乳狀液的物理穩(wěn)定性。

圖7 BSA-DEX共聚物的乳液黏度隨剪切速率的變化

3 結(jié)論

接枝反應(yīng)后,SDS-PAGE和FTIR分析證明了BSA與不同分子質(zhì)量 DEX 均形成了共聚物,且共聚物的結(jié)構(gòu)和功能特性較BSA發(fā)生了明顯的變化。接枝度越高的共聚物 (BDC 1、BDC 5)結(jié)構(gòu)變化越明顯,顏色越深,疏水性降低越顯著,BDC 5疏水性為(6.876±0.69)。熒光光譜分析表明,不同分子質(zhì)量的BDC共聚物均能夠?qū)е聼晒忖绲陌l(fā)生,低分子質(zhì)量 DEX(1 kDa、5 kDa)與BSA形成的共聚物熒光猝滅現(xiàn)象更顯著,且最大發(fā)射波長的紅移程度變化越大,說明較高接枝度的BDC共聚物具有更松散的三級結(jié)構(gòu)。乳化性分析表明,接枝反應(yīng)能夠提高BSA的乳化性(29.321±0.89) m2/g和乳化穩(wěn)定性(32.034±0.99)min,并且乳化性隨著接枝度的增加而增加,BDC 5的乳化性達(dá)到(49.058±0.88)m2/g,而高分子質(zhì)量 DEX 與BSA形成的共聚物具有更高的乳化穩(wěn)定性(57.357±0.47)min和黏度,這是因?yàn)楦叻肿淤|(zhì)量的DEX具有較高的空間位阻,會(huì)對乳液中液滴的聚集起到抑制的作用,增加乳液黏度,利于BDC共聚物乳液的穩(wěn)定。