植物乳桿菌CGMCC8198 β-羥脂酰-ACP脫水酶啟動(dòng)子的克隆及其冷激調(diào)節(jié)作用分析

周成慧,趙陽(yáng),王德行,席茂盛,羅學(xué)剛*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津,300457)2(天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心,天津,300457)

乳酸菌是目前最為公認(rèn)的一大類(lèi)益生菌,其食用安全,并可對(duì)人體發(fā)揮多種健康功能,在食品、醫(yī)藥、畜牧業(yè)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。溫度在乳酸菌的制備、儲(chǔ)存、應(yīng)用中有重要的影響。乳酸菌作為最理想的功能蛋白質(zhì)多肽類(lèi)藥物的口服投遞載體,在對(duì)外源基因進(jìn)行重組表達(dá)時(shí),低溫誘導(dǎo)往往能有助于降低包涵體形成、減少重組蛋白的降解,提高重組蛋白的生物活性[3-5],且能夠降低能耗、減少工業(yè)生產(chǎn)成本。

β-羥脂酰-ACP脫水酶(fabz)是Ⅱ型脂肪酸合成途徑中的重要酶,它主要負(fù)責(zé)催化β-羥脂酰-ACP脫水生成反-2-烯酰-ACP,其編碼基因是fabZ。如果fabZ被抑制,細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中的重要生物合成途徑將會(huì)受到阻斷,細(xì)菌無(wú)法生長(zhǎng)[6]。目前基于fabZ基因的研究大多在于其具體結(jié)構(gòu)與功能[7-9],尚未有文獻(xiàn)報(bào)道溫度與其轉(zhuǎn)錄調(diào)控間的關(guān)系。本研究在分析植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CGMCC8198在不同溫度處理后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn),fabZ基因在溫度降低時(shí)表達(dá)量明顯上調(diào)。為明確這一低溫誘導(dǎo)特性,本研究首先使用生物信息學(xué)方法對(duì)基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)[10-13],再以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因構(gòu)建啟動(dòng)子報(bào)告分析質(zhì)粒,驗(yàn)證了fabZ基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性及其受溫度影響的情況,以期為深入探究乳酸菌冷激應(yīng)答與fabZ基因功能機(jī)理及構(gòu)建乳酸菌低溫誘導(dǎo)表達(dá)載體奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和載體

植物乳桿菌TCCC11824(CGMCC No.8198)、EscherichiacoliDH5α、E.coliBL21(DE3)、質(zhì)粒pENTR223-CGREF1-EGFP、質(zhì)粒pET28a+,均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

質(zhì)粒小提試劑盒,北京索萊寶科技有限公司；限制性內(nèi)切酶,Fermentas公司；T4DNA連接酶,Thermo Scientific公司；PfuDNA聚合酶和dNTPs,北京康為世紀(jì)生物科技公司。本實(shí)驗(yàn)選用PCR引物以及序列測(cè)序均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成(表1)。5020 Arktik Thermal Cycler,美國(guó)Thermo公司；M200PRO 型光柵型多功能酶標(biāo)儀,瑞士帝肯有限公司；BX53F型正置熒光顯微鏡,日本OLYMPUS會(huì)社。

表1 引物名稱(chēng)與序列

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄

細(xì)菌總RNA提取后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,逆轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系及條件為：2.5 μg RNA,1 μg隨機(jī)引物,2 μL 10 mmol/L的dNTPs,6.375 μL DEPC水；70 ℃放置5 min后,迅速冰浴2 min；依次加入5 μL的5×Buffer,5 μL 0.1 mol/L的dNTP,40 U/μL的RNA酶抑制劑0.625 μL,1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(200 U/μL)混勻,37 ℃反應(yīng)1 h；70 ℃放置15 min,-20 ℃保存。反應(yīng)條件：95 ℃,5 min；95 ℃,30 s；退火溫度50 ℃,30 s；72 ℃,30 s,30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.2fabZ基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

將fabZ基因在美國(guó)國(guó)家技術(shù)信息中心網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進(jìn)行BLAST同源性分析與查找,然后利用MEGA 7.0軟件對(duì)所有fabZ基因進(jìn)行分析,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 基因序列分析

利用BPROM(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom&group=programs&subgroup=gfindb)和BDGP(https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)；利用IPSW(https://home.jbnu.ac.kr/NSCL/PseDNC-DL.htm)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定啟動(dòng)子真?zhèn)渭捌鋸?qiáng)度。使用WebLogo 3.0(http://weblogo.threeplusone.com)對(duì)預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子序列-10、-35區(qū)創(chuàng)建序列徽標(biāo)圖。

1.2.4 載體的構(gòu)建與鑒定

以質(zhì)粒pENTR223-CGREF1-EGFP為模板,F-E、F-R為引物,擴(kuò)增得到基因EGFP,反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s；56 ℃ 45 s；72 ℃ 1 min；循環(huán)30次,72 ℃ 10 min。將EGFP目的片段插入pET28a載體的EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)構(gòu)建載體pET28a-EGFP。以L.plantarumCGMCC8198的cDNA為模板,F-Z、R-Z為引物擴(kuò)增fabZ基因的啟動(dòng)子區(qū)域,反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s；55 ℃ 45 s；72 ℃ 45 s；循環(huán)35次,72 ℃,10 min。將啟動(dòng)子區(qū)域插入pET28a-EGFP載體的BglII與XbaI酶切位點(diǎn)之間構(gòu)建載體pET28a-PfabZ-EGFP。

1.2.5 熒光顯微鏡的檢測(cè)

提取構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-EGFP、pET28a-PfabZ-EGFP分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。同時(shí)轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pET28a+作為陰性對(duì)照。重組菌株接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,于37 ℃下,培養(yǎng)至OD600約為0.6～0.8時(shí),將搖瓶置于14 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。離心收集菌體,PBS洗滌重懸,使用正置熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞EGFP熒光表達(dá)情況。

1.2.6 酶標(biāo)儀檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度

將含有重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-EGFP、pET28a-PfabZ-EGFP的菌株接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別為T(mén)7-14、T7-37、fabZ-14、fabZ-37組。在37 ℃培養(yǎng)至OD600約為0.6～0.8時(shí),將T7-14,fabZ-14組搖瓶放置于14 ℃低溫培養(yǎng)20、40和60 min,收集不同時(shí)間的菌液。T7-37、fabZ-37組放置于37 ℃,同14 ℃組進(jìn)行取樣。PBS洗滌重懸菌體,使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)EGFP熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)510 nm)[14],同時(shí)測(cè)其OD600值,以空質(zhì)粒pET28a+轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)誘導(dǎo)培養(yǎng)作為對(duì)照去除背景干擾,相對(duì)熒光強(qiáng)度(RFU/OD600)為熒光強(qiáng)度值比對(duì)應(yīng)細(xì)胞密度OD600值。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫刺激后乳酸菌的基因相對(duì)表達(dá)情況

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所選擇的目的基因fabZ在乳酸菌接受冷刺激不同時(shí)間后的轉(zhuǎn)錄情況,結(jié)果如圖1所示。fabZ基因在低溫刺激后mRNA相對(duì)表達(dá)量上調(diào),4 ℃低溫刺激20 min時(shí)其表達(dá)量大約是在37 ℃時(shí)的3.7倍;40 min時(shí)其差異達(dá)到最大為6倍;1 h后4 ℃時(shí)的mRNA相對(duì)表達(dá)量大約是37 ℃時(shí)的4倍,表明fabZ基因有低溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄上調(diào)的特點(diǎn)。

a-基因表達(dá)水平的電泳檢測(cè)圖;b-基因相對(duì)表達(dá)量

2.2 基于fabZ基因序列構(gòu)建的分子進(jìn)化樹(shù)

使用MEGA 7.0軟件,將L.plantarumCGMCC8198的fabZ基因與其他11個(gè)不同近緣物種的乳酸菌的fabZ基因進(jìn)行聚類(lèi)分析,建立其發(fā)育樹(shù)。結(jié)果如圖2所示,L.plantarumCGMCC8198fabZ基因與乳桿菌屬fabZ基因的親緣關(guān)系最近,同源性最高達(dá)到100%；與片球菌屬接近,基因同源性為76%；乳酸菌屬則聚為另一支為55%。同鏈球菌屬的遺傳距離相距較遠(yuǎn),是單獨(dú)的一個(gè)分支。而已有文獻(xiàn)報(bào)道顯示Lactococcusgarvieaestrain PAQ102015-99 A7X72的fabZ基因(ID:NZ_LXWL01000001.1)與促進(jìn)冷加工有關(guān)[15],說(shuō)明該基因可能更早起源于鏈球菌,且與低溫應(yīng)答有一定關(guān)系。

圖2 fabZ基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 生物信息學(xué)方法對(duì)啟動(dòng)子主要元件的分析

生物信息學(xué)結(jié)果顯示fabZ基因前500 bp區(qū)域內(nèi)存在潛在的啟動(dòng)子。IPSW數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定fabZ是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子。其結(jié)果(圖3-a)顯示序列中有明顯的-10、-35區(qū)域,轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)序列顯示與rpoD15轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合有關(guān),WebLogo 3.0保守性鑒定(圖3-b)顯示-10區(qū)、-35區(qū)的6個(gè)核苷酸序列中的位置分別與經(jīng)典的-10區(qū)(TATAAT)、-35區(qū)(TTGACA)相似。

a-fabZ基因啟動(dòng)子序列;b-fabZ基因啟動(dòng)子-10、-35區(qū)保守性鑒定

2.4 pET28a-PfabZ-EGFP重組表達(dá)載體的構(gòu)建

圖4-a中pET28a-EGFP重組質(zhì)粒通過(guò)EcoRI、NotⅠ雙酶切和PCR產(chǎn)物鑒定,pET28a-PfabZ-EGFP質(zhì)粒通過(guò)BglII、XbaⅠ雙酶切和PCR產(chǎn)物鑒定(圖4-b),分別得到符合預(yù)期的目標(biāo)條帶,表明質(zhì)粒構(gòu)建成功,再進(jìn)行測(cè)序后,將測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子用于下一步試驗(yàn)。

M-marker;1-pET28a+質(zhì)粒；2-EGFP PCR產(chǎn)物；3-pET28a-EGFP采用EcoRI 和 NotI雙酶切；4-pET28a-EGFP質(zhì)粒；5-PfabZ PCR產(chǎn)物；6-pET28a-PfabZ-EGFP采用BglII 和 XbaI雙酶切

2.5 綠色熒光蛋白檢測(cè)啟動(dòng)子表達(dá)情況

使用熒光顯微鏡檢測(cè)重組細(xì)胞EGFP表達(dá)情況,在重組菌細(xì)胞內(nèi)觀察到產(chǎn)生的熒光(圖5),不含綠色熒光蛋白的載體未出現(xiàn)熒光,結(jié)果說(shuō)明啟動(dòng)子PfabZ可調(diào)控綠色熒光蛋白的表達(dá)。確定插入的片段具有啟動(dòng)子功能,證明構(gòu)建所得的啟動(dòng)子探針質(zhì)粒成功分離并鑒定出fabZ基因的啟動(dòng)子。

圖5 綠色熒光蛋白在重組菌株中表達(dá)

2.6 EGFP 熒光強(qiáng)度的定量檢測(cè)

利用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)對(duì)數(shù)期含不同啟動(dòng)子菌株的菌體密度以及EGFP的熒光相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。菌體生長(zhǎng)如圖6-a所示,在14與37 ℃,2株菌生長(zhǎng)趨勢(shì)相似,說(shuō)明啟動(dòng)子的改變未對(duì)菌株的生長(zhǎng)造成影響。在14 ℃低溫環(huán)境下,含T7啟動(dòng)子和fabZ啟動(dòng)子的菌株緩慢生長(zhǎng),但含有fabZ啟動(dòng)子的菌株的相對(duì)熒光強(qiáng)度卻明顯增加,說(shuō)明啟動(dòng)子效應(yīng)增強(qiáng)。

a-低溫刺激1 h 重組菌的生長(zhǎng)曲線；b-各啟動(dòng)子在不同溫度下的相對(duì)熒光強(qiáng)度

被PfabZ啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)綠色熒光蛋白的大腸桿菌在14 ℃的蛋白表達(dá)量明顯高于37 ℃時(shí)的蛋白表達(dá)量,20 min時(shí),是37 ℃的1.30倍；40 min時(shí),差異最大達(dá)到2.38倍;1 h后差異變?yōu)?.42倍。且在14 ℃時(shí)的蛋白表達(dá)量與含PT7的重組菌的表達(dá)量相當(dāng)(圖6-b)。推測(cè)PfabZ啟動(dòng)子中可能含有與低溫誘導(dǎo)表達(dá)相關(guān)的結(jié)合位點(diǎn),在低溫刺激后可啟動(dòng)EGFP的表達(dá)。而被PT7誘導(dǎo)的大腸桿菌在14 ℃的蛋白表達(dá)量與37 ℃時(shí)的蛋白表達(dá)量由在20 min時(shí)的1.13倍的差異變?yōu)?.74倍,最后變?yōu)?.58倍,推測(cè)其在低溫下表達(dá)受到抑制。這些結(jié)果證實(shí)fabZ啟動(dòng)子可用于構(gòu)建低溫誘導(dǎo)型重組表達(dá)質(zhì)粒。

3 結(jié)果與討論

低溫下誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白可以提高易凝集蛋白的可溶性,從而獲得活性高的蛋白質(zhì)或者多肽。一些重要的低溫酶及功能性低溫蛋白基因在常溫下啟動(dòng)子無(wú)法正常轉(zhuǎn)錄,或者即使被轉(zhuǎn)錄表達(dá),也可能因?yàn)榈蜏氐鞍椎臒岱€(wěn)定性差、常溫下不正確折疊而失活。因此分離得到能在低溫下高效表達(dá)的啟動(dòng)子具有重要意義。此前研究分別在低溫菌[16]和深海細(xì)菌[17]中成功篩到低溫啟動(dòng)子,并在大腸桿菌成功表達(dá)。本研究從乳酸菌轉(zhuǎn)錄組中篩選出了低溫強(qiáng)啟動(dòng)子PfabZ,在大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),其低溫誘導(dǎo)強(qiáng)度與T7啟動(dòng)子相當(dāng),可用于構(gòu)建適于熱不穩(wěn)定蛋白質(zhì)高效表達(dá)的低溫外源蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。同時(shí),本研究構(gòu)建的啟動(dòng)子報(bào)告分析質(zhì)粒具有檢測(cè)靈敏度高、結(jié)果直觀、篩選過(guò)程簡(jiǎn)單、迅速等優(yōu)點(diǎn),亦可應(yīng)用于其調(diào)節(jié)劑的篩選及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理研究等工作,為其深入研究打下基礎(chǔ)。

乳酸菌低溫脅迫應(yīng)激機(jī)制的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展,但仍有許多難點(diǎn)未解決。目前,大部分的研究主要停留在細(xì)胞水平,從分子水平上闡述乳酸菌環(huán)境脅迫機(jī)制的研究還不是很充分。另一方面,隨著新一代測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展,更多的生物基因組序列被逐步確定,但對(duì)大量涌現(xiàn)的基因功能的挖掘則遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,探究乳酸菌基因組中的功能序列元件為闡明其轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子機(jī)制、提升其應(yīng)用水平具有重要價(jià)值[18]。本研究首次發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌的fabZ是一個(gè)低溫上調(diào)基因,KEGG通路分析表明此基因參與脂肪酸的代謝及合成[19]。許多研究表明在各種不利環(huán)境下乳酸菌細(xì)胞膜脂肪酸含量與組成都會(huì)發(fā)生調(diào)整,從而使細(xì)胞膜能夠在較差環(huán)境下保持流動(dòng)性,以提高細(xì)胞膜的抗逆性[20]。本研究提示fabZ也可能通過(guò)影響細(xì)胞脂肪酸代謝,在乳酸菌抵御低溫脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,這些發(fā)現(xiàn)將為揭示乳酸菌在生產(chǎn)、儲(chǔ)存等過(guò)程中受到溫度影響下的應(yīng)答機(jī)制及提升生產(chǎn)工藝,提供一些新的思路。