伴礦景天耐鎘內(nèi)生菌的篩選

郭 峰，周毅吉，徐遠(yuǎn)芳，李文革，彭 玲，張 勇，鄧 超，張祺玲

（湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

隨著城市化、工業(yè)化、農(nóng)業(yè)集約化的快速發(fā)展，環(huán)境污染問(wèn)題日漸突出[1]。2014 年 4 月我國(guó)環(huán)境保護(hù)部和國(guó)土資源部公布的《全國(guó)土壤污染調(diào)查公報(bào)》顯示，我國(guó)土壤主要遭受以重金屬為代表的無(wú)機(jī)物污染，其中鎘是主要的重金屬污染物之一，存在于各種土地類(lèi)型中，含量分布呈現(xiàn)從西北到東南、從東北到西南方向逐漸升高的態(tài)勢(shì)，點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)到7%[2]。研究高效便捷的鎘污染修復(fù)技術(shù)刻不容緩。

目前，大部分物理化學(xué)修復(fù)方法不僅成本高昂，而且會(huì)對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)造成一定破壞[3]。這使得重金屬鎘污染土壤生態(tài)修復(fù)技術(shù)研究成為多個(gè)科技研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。雖然已發(fā)現(xiàn)一些超累積植物能吸收高濃度的重金屬鎘[4-5]，但是這些植物大多數(shù)生物量極低且生長(zhǎng)緩慢，同時(shí)對(duì)重金屬存在偏好，從而制約了其在土壤重金屬污染中的修復(fù)效率[6]。因此，制定適宜的植物修復(fù)強(qiáng)化策略對(duì)修復(fù)重金屬鎘污染的土壤具有重要意義。為了提高植物修復(fù)效率，許多學(xué)者研究了植物-微生物-重金屬之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)某些微生物具有減輕重金屬誘導(dǎo)的植物毒性和增加生物量的作用[7-9]。從此，增強(qiáng)植物修復(fù)體系中微生物的功能成為生物修復(fù)技術(shù)研究的一個(gè)重要方向。

植物和內(nèi)生菌通過(guò)長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化形成互惠互利的關(guān)系，彼此構(gòu)成了穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系，維持著自然系統(tǒng)生態(tài)平衡[10]。研究表明，內(nèi)生菌產(chǎn)生的代謝物，或能刺激植物的生長(zhǎng)發(fā)育，提高宿主植物對(duì)生物脅迫或非生物脅迫的抵抗能力，在污染土壤植物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力[11]。該研究從鎘污染區(qū)域生長(zhǎng)的超富集植物伴礦景天植株中分離篩選獲得2 株具有耐鎘特性的細(xì)菌菌株，通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化特性及16S rDNA 序列和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)將其鑒定為無(wú)色桿菌和伯克霍爾德氏菌，同時(shí)對(duì)菌株的耐鎘能力進(jìn)行了評(píng)估，為耐鎘內(nèi)生菌株的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植株伴礦景天（Sedum plumbizincicola）采集自湖南省長(zhǎng)沙市長(zhǎng)沙縣高橋鎮(zhèn)鎘污染區(qū)域，取樣后于48 h 內(nèi)用其根莖葉健康組織進(jìn)行植物內(nèi)生菌的富集和分離。用于細(xì)菌培養(yǎng)的LB 培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨10 g、酵母提取物 5g、NaCl 10 g、固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉15～20 g，加水至1 000 mL，pH 值7.2，121℃滅菌30 min。耐鎘細(xì)菌篩選培養(yǎng)基，即在LB 培養(yǎng)基中加入 CdCl2溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 耐鎘內(nèi)生菌株的分離 將伴礦景天植株根莖葉用清水洗凈，75%乙醇浸泡1 min，5%NaClO 浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗4 次，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證消毒效果后在無(wú)菌條件下研磨植株組織，置于Cd2+濃度為100 mg/L的LB 培養(yǎng)基中，30℃下150 r/min 振蕩培養(yǎng)3 d，采用稀釋涂布法分離耐鎘內(nèi)生菌，再分別進(jìn)行劃線純化。

1.2.2 耐鎘內(nèi)生菌株的篩選 取分離純化菌株一環(huán)置于LB 培養(yǎng)基中，30℃下150 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，分別取0.2 mL 培養(yǎng)液涂布于Cd2+濃度分別為200～1 000 mg/L 的LB 固體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察菌株生長(zhǎng)情況，篩選出耐受能力較高的菌株，斜面保存。

1.2.3 耐鎘菌株的生理生化特性分析 挑取耐鎘菌株的單菌落接種于LB 培養(yǎng)基中，30℃下150 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[12]進(jìn)行革蘭氏染色；參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[14]進(jìn)行細(xì)菌常規(guī)的生理生化鑒定試驗(yàn)。

1.2.4 耐鎘菌株16S rRNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 采用DNA 提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，采用細(xì)菌通 用 引 物27F（5-′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行16S rRNA 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）為：PCR Mix 25 μL，27F（10 μM）2 μL，1492R（10 μM）2 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR 反應(yīng)條件為：98℃2 min； 98℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 10 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃5 min 終止。PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，采用凝膠回收試劑盒切膠回收后，交由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast同源比對(duì)分析，利用MEGA 軟件構(gòu)建16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 鎘離子對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 耐鎘菌株分別接種于LB 培養(yǎng)基中，30℃下150 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，以2%的接種量分別接種于Cd2+濃度為0、50、100、200 和400 mg/L 的200 mL LB 培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，每24 h取樣1 次，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)液在600 nm 處的OD 值，研究Cd2+濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)特性的影響。

1.2.6 耐鎘菌株對(duì)不同抗生素耐性研究 采用K-B 藥敏紙片擴(kuò)散法對(duì)耐鎘菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。吸取濃度為108CFU/mL 耐鎘菌液0.1 mL 涂布于LB 固體培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)基上菌液稍干，用無(wú)菌鑷子夾取藥敏片平放在培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基均勻放置3 片藥敏片，30℃下培養(yǎng)48 h，測(cè)量菌抑菌圈大小，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì) （Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的紙片擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定?？股厮幟羝ǎ郝让顾亍⑺沫h(huán)素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、諾氟沙星、紅霉素、鏈霉素、氨芐西林、青霉素和慶大霉素。

1.2.7 耐鎘菌株能譜分析 將耐鎘菌株分別接種于LB 培養(yǎng)基中，30℃下150 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，以2%的接種量分別接種于Cd2+濃度為0、100 和500 mg/L的LB 培養(yǎng)基中，30℃下振蕩培養(yǎng)24 h，細(xì)菌菌體經(jīng)去離子水洗滌3 次，真空干燥后應(yīng)用能譜儀對(duì)菌體元素分布進(jìn)行定性定量分析。

1.2.8 耐鎘菌株紅外光譜分析 耐鎘菌株分別接種于LB 培養(yǎng)基中，30℃下150 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，以2%的接種量分別接種于Cd2+濃度為0、100 和500 mg/L的LB 培養(yǎng)基中，30℃下振蕩培養(yǎng)24 h，細(xì)菌菌體經(jīng)去離子水洗滌 3 次后，真空干燥，取1 mg 干燥樣品與100 mg KBr（光譜純）磨細(xì)混勻，在10 t/cm2下壓成薄片，用 FTIR 光譜儀測(cè)定并記錄紅外光譜[15-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鎘內(nèi)生細(xì)菌菌株的分離篩選

經(jīng)Cd2+濃度為100 mg/L 的LB 固體培養(yǎng)基上多次分離純化，共分離出8 種菌落形態(tài)不同的耐鎘內(nèi)生菌株，8 種菌株經(jīng)Cd2+濃度梯度篩選培養(yǎng)，最高耐受濃度見(jiàn)圖1。從圖1 可以看出，8 株細(xì)菌均能在Cd2+濃度為400 mg/L 的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其中菌株JGY61 和JGG81 的最高耐受濃度分別達(dá)800 和850 mg/L，因此選擇菌株JGY61和JGG81進(jìn)行下一步研究。

圖1 耐鎘內(nèi)生細(xì)菌菌株最高耐受濃度

2.2 耐鎘菌株生理生化特性及16S rRNA 序列分析

2.2.1 耐鎘菌株的生理生化特性 菌株JGY61 在光學(xué)顯微鏡下菌體呈短桿狀，革蘭氏染色陰性；菌株JGG81 在光學(xué)顯微鏡下菌體呈桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性。2 個(gè)菌株部分生理生化特征見(jiàn)表1。

表1 耐鎘內(nèi)生細(xì)菌菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 耐鎘菌株的16S rRNA 序列分析 2 個(gè)菌株DNA 經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物大小約為1 500 bp，其中菌株JGY61 的16S rDNA 序列擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 461 bp，菌株JGG81 的16S rDNA 序列擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 465bp。測(cè)序序列通過(guò)Blast 同源比對(duì)分析后利用MEGA軟件構(gòu)建16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2 所示，菌株JGY61 與無(wú)色桿菌屬的細(xì)菌菌株親緣關(guān)系最近，菌株JGG81 與伯克霍爾德氏菌屬的細(xì)菌菌株親緣關(guān)系最近。綜合菌株生理生化特性、16S rRNA 序列及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，分離到的耐鎘內(nèi)生菌株JGY61 和JGG81 分別為無(wú)色桿菌和伯克霍爾德氏菌。

圖2 耐鎘內(nèi)生細(xì)菌菌株的16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 Cd2+濃度對(duì)耐鎘內(nèi)生菌株生長(zhǎng)的影響

由圖3 可知，隨著Cd2+濃度的增加，菌株的生長(zhǎng)期逐漸延長(zhǎng)，但當(dāng)Cd2+濃度達(dá)400 mg/L 時(shí)，菌株穩(wěn)定期OD 值均未受明顯影響，說(shuō)明菌株可能通過(guò)某些方式對(duì)Cd2+濃度進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整，減弱Cd2+對(duì)菌株的影響，使菌株具有較強(qiáng)的耐鎘能力，從而不影響菌株的生物量。

圖3 不同Cd2+濃度處理下菌株的生長(zhǎng)曲線

2.4 耐鎘菌株對(duì)不同抗生素的耐性

由表2 可知，菌株JGY61 對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素四環(huán)素敏感，對(duì)糖肽類(lèi)抗生素卡那霉素、β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素氨芐西林、四環(huán)素類(lèi)抗生素氯霉素和喹諾酮類(lèi)抗生素環(huán)丙沙星耐性中介，對(duì)其余抗生素耐性較強(qiáng)；菌株JGG81 對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素氯霉素和四環(huán)素敏感，對(duì)糖肽類(lèi)抗生素卡那霉素和喹諾酮類(lèi)抗生素環(huán)丙沙星耐性中介，對(duì)其余抗生素耐性較強(qiáng)。

表2 耐鎘內(nèi)生菌株對(duì) 10 種抗生素的敏感性結(jié)果

2.5 耐鎘內(nèi)生菌株菌體能譜分析

由圖4 可以看出，菌株JGY61 和JGG81 在有Cd2+條件下菌體細(xì)胞壁均能檢測(cè)出鎘元素存在，在Cd2+濃度為100、500 mg/L 條件下培養(yǎng)后，菌株JGY61 菌體表面鎘元素分別占總元素的0.6%、40.2%（原子百分比），菌株JGG81 菌體表面鎘元素分別占總元素的1.5%、2.8%（原子百分比），表明菌株可能對(duì)鎘離子存在不同程度的表面吸附作用。

圖4 耐鎘菌株的菌體能譜分析圖譜

2.6 耐鎘內(nèi)生菌株菌體紅外分析

從圖5 可以看出，Cd2+處理后耐鎘細(xì)菌細(xì)胞壁表面化學(xué)基團(tuán)發(fā)生變化的主要有：3 300 cm-1左右來(lái)自蛋白質(zhì)C—H 鍵、N—H 鍵的伸縮以及碳水化合物中結(jié)合水O—H 的伸展振動(dòng)；2 927 cm-1左右飽和C—H 鍵；1 650 cm-1左右酰胺（O=CN—N）Ⅰ帶C=O 的伸縮振動(dòng)；1 540 cm-1左右蛋白質(zhì)酰胺II 帶N—H 的彎曲振動(dòng)與C—N 伸展振動(dòng)的疊加；1 395 cm-1左右—CH2、CH3、COO—等 基 團(tuán)；1 240 cm-1左 右P=O 和C—S 的伸縮振動(dòng)以及C—O 與O—H 的疊加吸收峰；1 080 cm-1左右—PO43-、胺基中的C—N 的伸縮振動(dòng)和糖環(huán)的振動(dòng)吸收帶；550 cm-1左右M—O 和O—M—O （M—金屬離子） 振動(dòng)吸收峰。低濃度Cd2+處理下菌體細(xì)胞壁表面化學(xué)集團(tuán)主要發(fā)生輕微位移，高濃度Cd2+處理下1 080 cm-1左右—PO43-、胺基中的C—N的伸縮振動(dòng)和糖環(huán)的振動(dòng)吸收帶以及550 cm-1左右—M—O 和O—M—O（ M—金屬離子）振動(dòng)吸收峰變得強(qiáng)而寬，1 540 cm-1左右蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶N—H 的彎曲振動(dòng)與C—N 伸展振動(dòng)的疊加吸收峰變?nèi)?，說(shuō)明參與積累重金屬的化學(xué)官能團(tuán)主要有—PO43-、—M—O（O—M—O）、胺基中的C—N 和酰胺基（—CO—NH—）基團(tuán)。

圖5 耐鎘菌株的菌體紅外光譜圖

3 結(jié)論與討論

研究以鎘污染區(qū)域生長(zhǎng)的伴礦景天為材料，從中分離到8 種菌落形態(tài)不同的耐鎘內(nèi)生菌株，經(jīng)Cd2+濃度梯度篩選得到2 株耐鎘能力較強(qiáng)的菌株，最高耐受濃度分別達(dá)800 和850 mg/L，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特性研究以及16S rDNA 序列和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，將2 株菌株分別鑒定為無(wú)色桿菌和伯克霍爾德氏菌。耐鎘菌株在不同鎘濃度培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明，菌株隨著Cd2+濃度的增加生長(zhǎng)期逐漸延長(zhǎng)，說(shuō)明在Cd2+影響下菌株生長(zhǎng)存在適應(yīng)性調(diào)整過(guò)程；但經(jīng)適應(yīng)性調(diào)整后在培養(yǎng)基中Cd2+濃度達(dá)400 mg/L 時(shí)2 株菌株的生物量均未受明顯影響，該調(diào)整機(jī)理有待進(jìn)一步研究。綜上所述，篩選獲得的2 株伴礦景天內(nèi)生細(xì)菌有較好的耐鎘能力，為鎘污染土壤植物-微生物聯(lián)合修復(fù)提供了寶貴的微生物資源。

對(duì)2 株耐鎘內(nèi)生菌進(jìn)行了抗生素耐性測(cè)定，結(jié)果顯示，菌株JGY61（無(wú)色桿菌）對(duì)四環(huán)素敏感，對(duì)卡那霉素、氨芐西林、氯霉素和環(huán)丙沙星耐性中介，對(duì)青霉素、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、諾氟沙星耐性較強(qiáng)；菌株JGG81（伯克霍爾德氏菌）對(duì)氯霉素和四環(huán)素敏感，對(duì)卡那霉素和環(huán)丙沙星耐性中介，對(duì)青霉素、氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、諾氟沙星耐性較強(qiáng)。

相關(guān)研究表明，微生物與重金屬鎘的相互作用方式主要有4 種：表面吸附、胞外絡(luò)合、胞外沉淀和微生物積累[18]。對(duì)該研究分離獲得的耐鎘內(nèi)生菌株進(jìn)行能譜分析，發(fā)現(xiàn)菌株在Cd2+存在條件下菌體細(xì)胞壁均能檢測(cè)出鎘元素存在，表明菌株可能對(duì)鎘離子存在不同程度的表面吸附作用。紅外分析結(jié)果表明，—PO43、—M—O（O—M—O）、胺基中的C—N 和酰胺基（—CO—NH—）基團(tuán)是參與菌株表面吸附的主要官能團(tuán)。由此初步證實(shí)，菌體細(xì)胞壁及其官能團(tuán)在吸附鎘中的作用，其耐性與解毒機(jī)理有待進(jìn)一步加以揭示。