HPLC-MS/MS快速測(cè)定飼料中25種喹諾酮類(lèi)藥物

嚴(yán) 明， 嚴(yán) 寒，唐 建， 吳 濤， 覃曉明， 潘芳菲， 蘭 玉

（廣西壯族自治區(qū)飼料監(jiān)測(cè)所，廣西南寧530001）

目前，喹諾酮類(lèi)藥物（QNs）已經(jīng)生產(chǎn)4代藥物，其中NAL為第一代QNs的代表，包括OXO、PRA等品種；第二代QNs以PPA、CIN為代表；第三代QNs以CIP、NOR、OFX等為典型代表；第四代QNs包括MOX、BAL、GAT等。這幾代化合物結(jié)構(gòu)中的萘啶環(huán)被進(jìn)行了修飾，具有抗菌譜逐漸擴(kuò)大、吸收快和生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)（Karl Drlica等，2009；郭少忠等，2008），因此在養(yǎng)殖業(yè)被廣泛應(yīng)用。然而QNs隨食物鏈進(jìn)入人體代謝蓄積，造成毒副作用（汪皓琦等，2017；高瑋岐等，2017），并對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破壞（Gullberg等，2011；Kümmerer等，2009）。近年來(lái)，QNs抗生素的耐藥性問(wèn)題也開(kāi)始被重視。為此，自2005起，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）禁止ENR使用（FDA，2005）；2015年農(nóng)業(yè)部在規(guī)定停止經(jīng)營(yíng)和使用NOR、LOM、OFX、PFN 4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告 第2292號(hào)，2017）；2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布194號(hào)公告，規(guī)定自2020年7月1日起，停止所有促生長(zhǎng)類(lèi)藥物飼料添加劑的生產(chǎn)，QNs正式在飼料中禁用（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第194號(hào)，2020）。為了監(jiān)控飼料中QNs的非法使用，需要建立飼料中抗生素的檢測(cè)方法。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于QNs檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法（陳浩等，2020；李新朋等，2014；Scortichini等，2009）、高效液相色譜法（譚美英等，2012；Gbylik等，2012；惠蕓華等，2010；Galarini等，2009；施杏芬等，2008）、高效液相色譜質(zhì)譜法等（賈濤等，2019；柯慶青等，2019；候美玲等，2018；Samanidou等，2008；Rubies等，2007）。酶聯(lián)免疫法僅使用于單類(lèi)QNS的檢測(cè)，需要較好的凈化手段。液相色譜法對(duì)樣品基質(zhì)要求較高，檢測(cè)限較高，無(wú)法滿(mǎn)足痕量檢測(cè)要求；近年應(yīng)用LC-MS/MS進(jìn)行QNs精確定量和確證方法研究日趨增多，然而大多數(shù)檢測(cè)方法僅檢測(cè)飼料中1～16種藥物，缺乏對(duì)4代QNs藥物的同步檢測(cè)方法。為此，本實(shí)驗(yàn)旨在建立利用LC-MS/MS測(cè)定飼料中25種（表1），涵蓋4代QNS藥物的方法。

表1 25種QNs名稱(chēng)及化合物信息

1 材料與方法

1.1 儀器與材料Acquity UPLC-Xevo TQS（Waters，美國(guó)）：配有電噴霧離子源（ESI）；超聲清洗器（西班牙，F(xiàn)ungilab）；自動(dòng)渦旋混合器（QL-901Vortex，其林貝爾儀器制造有限公司，海門(mén)市）；臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)，Sigma）；尼龍有機(jī)濾膜（0.22 μm，安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，上海）；超純水器（MILLIPORE，美國(guó)）；N-Evap nitrogen evaporator氮吹儀（Organomation Associates，美國(guó)）；各型號(hào)移液槍?zhuān)‥ppendorf，德國(guó)）；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）（Waters，美國(guó)）；甲酸（色譜純級(jí)，Sigma）；乙腈和甲醇（色譜純級(jí)，F(xiàn)isher ChenAlert Guide）；其他試劑為分析純；實(shí)驗(yàn) 用 水：Mili-Q純 化 超 純 水 （＞18 MΩ）；Oasis HLB，MCX SPE柱（3 mL，60 mg，Waters，美國(guó)）；Estela prime HLB SPE柱（3 mL，60 mg，大連沈源檢驗(yàn)檢測(cè)咨詢(xún)有限公司）。NAL等23種QNs標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度1000 mg/L）；BAL標(biāo)準(zhǔn)品、TRO標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，DR.E有限公司，德國(guó)），各取適量，精密稱(chēng)重后，分別溶解在甲醇中，置同一容量瓶中制成BAL、TRO質(zhì)量濃度為500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封后-20℃儲(chǔ)存，工作有效期6個(gè)月。

吸取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備成500 ng/mL的25種QNs混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 樣品前處理 稱(chēng)取5 g飼料樣品（精確到0.01 g），在50 mL聚丙烯離心管中，加入一定量的混合內(nèi)標(biāo)備用工作液，旋轉(zhuǎn)混勻10 s。加入20 mL 1%甲酸乙腈溶液，渦旋混合1 min，超聲提取30 min；，離心3 min（轉(zhuǎn)速9000 r/min）。取5 mL上清液，注入Oasis PRiME HLB固相萃取柱，接收于10 mL離心管中，用氮?dú)獯祾咧两桑?0℃）。加1 mL的0.1%甲酸-乙腈（9:1，V/V）復(fù)溶液，渦旋30 s使其重新溶解。用0.22 μm尼龍濾膜過(guò)濾，然后用UPLC-MS/MS測(cè)定，對(duì)照組樣品處理方法同上。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1 液相色譜條件ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B-有機(jī)相，為0.1%甲酸乙腈；遵循梯度洗脫程序（表2）；樣品進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為25℃。

表2 液相梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜離子源為電噴霧源，正離子（ESI+）電離模式；毛細(xì)管電壓：3.5KV；離子源溫度（TEM）：150℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描；氣體霧化溫度：380℃；輔助氣：50 psi；氣簾氣：50 psi；錐孔氣、脫溶劑氣：氮?dú)?；采集前調(diào)試各參數(shù)，達(dá)到最佳靈敏度。25種QNs保留時(shí)間、質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表3。數(shù)據(jù)采集和處理使用MassLynx 4.1軟件完成。

表3 25種QNs保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇QNs分子結(jié)構(gòu)中都含有哌嗪氮基以及羧基，此類(lèi)化合物在酸性溶液中呈陽(yáng)離子模式。在質(zhì)譜選擇正離子模式下，容易形成[M+H]-離子。因此采用ESI+電離源，根據(jù)喹諾酮類(lèi)藥物的酸堿兩性化學(xué)性質(zhì)，其解離狀態(tài)根據(jù)pH的變化而呈現(xiàn)不同，流動(dòng)相的pH對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物在色譜柱中的分離和保留有很大影響。在流動(dòng)相中添加適量的甲酸溶液可有效提高ESI+的電離效率，有效改善峰形。最終選擇ACQUITY UPLC BEH C18（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）色譜柱對(duì)25種QNs進(jìn)行分離，將0.1%甲酸的水溶液和0.1%甲酸的乙腈用作流動(dòng)相。由于需要檢測(cè)QNs數(shù)量較多，等梯度洗脫無(wú)法有效分離這些藥物，因此，通過(guò)梯度洗脫來(lái)實(shí)現(xiàn)各分析物有效分離，各分析物的分析時(shí)間范圍為3.82 min（吡哌酸）～8.99 min（萘啶酸）。色譜圖如圖1所示。在10 min內(nèi)可以完成25種QNs有效分離。

2.2 提取溶劑選擇 根據(jù)已有的QNs殘留監(jiān)測(cè)研究，針對(duì)不同的基質(zhì)，采用不同溶液來(lái)提取目標(biāo)成分。主要可以歸納為有機(jī)溶劑提取和混合溶液提?。≒ena等，2010；Rodriguez等，2008）。目前從飼料中提取喹諾酮的研究?jī)H有少數(shù)報(bào)道，根據(jù)其他基于飼料分析報(bào)告，本研究選擇不同的提取溶劑研究飼料中QNs的提取效率，其中NAL、PPA、ENR和MOX分別作為不同代開(kāi)發(fā)藥物的QNs代表。比較了HCL溶液（0.1 mol/L）、，磷酸緩沖液（1 mol/L）、乙腈（色譜純）、蛋白酶溶液（10 g/L）、0.1%TFA-甲醇溶液和1%甲酸乙腈對(duì)四代QNs的提取回收率。各化合物不同提取方法的回收效率如圖2所示。結(jié)果表明1%甲酸乙腈對(duì)四代QNs的提取回收率有較好的提取效果。

圖2 不同提取液對(duì)各代QNs的提取效率

2.3 凈化條件選擇 實(shí)驗(yàn)考察了MCX、HLB和PRiME HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化富集效果的比較。結(jié)果表明，1%甲酸乙腈提取后化合物在MCX柱中部分保留，但均難以洗脫，回收率偏低。HLB柱可耐受pH范圍較廣，有較好的適用性，但HLB萃取柱需要1%甲酸乙腈濃縮成水相溶液，后續(xù)同時(shí)完成25種QNs復(fù)溶定容定量操作誤差較大，回收率不能全部達(dá)到較理想?yún)^(qū)間。Oasis PRiME HLB是一種新型開(kāi)發(fā)應(yīng)用的反相固相萃取吸附劑，無(wú)需活化和平衡步驟，去除蛋白、鹽、磷脂等95%以上的基質(zhì)干擾物，樣品更潔凈，基質(zhì)效應(yīng)更小，方法更加穩(wěn)定可靠且操作方便，儀器維護(hù)更輕松，使得溶液流速更順暢更快速，節(jié)省時(shí)間和溶液。因此最終選用Oasis PRiME HLB作為1%甲酸乙腈溶液的凈化富集柱。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察 按照既定方法稱(chēng)量空白飼料樣品并進(jìn)行處理，然后使用空白飼料樣品提取液制備一系列濃度不同的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定；同時(shí)將QNs混合標(biāo)準(zhǔn)工作液使用0.1%甲酸-乙腈（9：1，V/V）溶液稀釋成一系列濃度曲線測(cè)定；檢查溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)匹配曲線的斜率之比，以評(píng)估基質(zhì)效果。結(jié)果表明，飼料提取后基質(zhì)抑制效果，為準(zhǔn)確起見(jiàn)，采用基質(zhì)曲線作為線性驗(yàn)證計(jì)算。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性及定量計(jì)算 用提取凈化后的空白樣品提取液將標(biāo)準(zhǔn)工作液逐級(jí)稀釋?zhuān)渲茷?.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL系列濃度工作液，在已設(shè)定條件下用UPLC-MS/MS分析測(cè)定，通過(guò)將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度作為水平坐標(biāo)（x）和定量離子峰面積響應(yīng)值作為垂直坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸來(lái)計(jì)算結(jié)果，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表4中顯示了典型的線性回歸方程式和相關(guān)系數(shù)。

表4 25種QNs的線性、LOQ和LOD

2.5.2 檢出限與定量限 稱(chēng)取10份不同類(lèi)型的空白樣品，按照以上方法處理后測(cè)定，通過(guò)Mass-Lynx 4.1計(jì)算軟件信號(hào)強(qiáng)度（S）背景噪音強(qiáng)度（N）比值，QNs的檢測(cè)限濃度（LOD）為信噪比3倍（S/N＞3）時(shí)確定，QNs的定量限濃度（LOQ）為信噪比10倍（S/N＞10）時(shí)確定。25種QNs的LOQ與LOD見(jiàn)表4。

2.5.3 回收率與精密度 稱(chēng)取空白配合飼料、濃縮飼料樣品，按照低、中、高三個(gè)濃度添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照以上建立的方法提取處理后儀器測(cè)定。每個(gè)濃度進(jìn)行6次重復(fù)，并不同日間3批次重復(fù)測(cè)定。相對(duì)回收率用于檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差用于評(píng)價(jià)方法的精度。結(jié)果如表5所示。在10、100、200 ng/g添加水平，方法回收率為74.0%～98.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。

表5 飼料中25種QNs的回收率和精密度

3 結(jié)論

本文建立了應(yīng)用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中25種QNs的快速確認(rèn)方法。樣品中QNs用0.1%甲酸乙腈提取，經(jīng)PRiME HLB固相萃取柱凈化后，上HPLC-MS/MS分析，用0.1%甲酸水與乙腈做流動(dòng)相，梯度洗脫。此方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、定量準(zhǔn)確、測(cè)定濃度范圍寬，適用于各種飼料25種QNs的檢測(cè)。