微波提取五指毛桃總黃酮工藝研究

唐 森， 石佳香， 覃逸明， 吳國勇， 張 鵬*

（1.廣西科技師范學(xué)院 食品與生化工程學(xué)院，廣西來賓546199；2.廣西科技師范學(xué)院 特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點實驗室，廣西來賓546199；3.廣西科技師范學(xué)院 科研管理處，廣西來賓546199）

五指毛桃（Ficus hirta Vahl）是?？崎艑僦参?，又名粗葉榕、五指牛奶、土北芪等，因其葉片形狀像五指而得名（鐘小清，2001）。研究表明，其含有黃酮類、有機(jī)酸、氨基酸、三萜、生物堿、香豆素類等較多的活性成分及人體所需的礦質(zhì)元素（王偉偉等，2013；林慧等，2012），具有抗氧化、補(bǔ)益、提高免疫力、消炎鎮(zhèn)痛、平滑肌調(diào)節(jié)等作用，同時還能改善并保護(hù)消化和呼吸系統(tǒng)（趙帥等，2020；郭晨等，2019；李南薇等，2013；呂穎堅等，2008）。

目前，微波輔助提取技術(shù)廣泛應(yīng)用于較多天然產(chǎn)物的提取，而且微波輔助方法具有選擇性高、穿透力強(qiáng)、加熱效率高等特點 （Uquiche等，2008）。用微波輔助提取總黃酮可加快提取時間，而且提取效率較高，因而本試驗用乙醇為溶劑，通過微波輔助的方法提取五指毛桃中的總黃酮。綜上，本試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以五指毛桃總黃酮提取量為評價指標(biāo)，分別考察液料比、提取時間、提取功率、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對五指毛桃總黃酮提取量的影響。使用響應(yīng)面分析法對五指毛桃中總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為五指毛桃的后續(xù)研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑 供試材料：五指毛桃購于亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司，經(jīng)鑒定為五指毛桃。

供試試劑：試驗所用蘆丁，超純（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫，分析純（西隆科學(xué)股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備FW135型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA2004B型電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；XH-MC-1型祥鵠微波合成反應(yīng)儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ-D（III）型循環(huán)水多用真空泵（鞏義市科瑞儀器有限責(zé)任公司）；C-20型玻璃儀器氣流烘干器（上海貝侖儀器設(shè)備有限公司）；UV-9600型紫外/可見分光光度計（北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)）公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料前處理及樣品溶液的制備 用高速多功能粉碎機(jī)將五指毛桃原料粉碎，過60目篩后鋪開置于托盤中，在70℃的條件下，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干4 h后，裝袋備用。

稱取五指毛桃粉末2.00 g置于三頸燒瓶中，加入一定量的乙醇為提取溶劑，搖勻后用塞子塞住，靜置30 min，然后用微波合成提取儀進(jìn)行提取，最后將提取后的溶液抽濾，取濾液用相同體積分?jǐn)?shù)的乙醇定容，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法（李建鳳等，2020；Sakanaka等，2005），并稍作修改，精密稱取0.0200 g的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用70%的乙醇溶解，定容至100 mL容量瓶中，配制成0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，搖勻備用。分別精密吸取0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品對照溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL置于10 mL具塞比色管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，使得溶液的總體積為2 mL，搖勻，再依次分別加入5%的亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻靜置6 min，再加入10%的硝酸鋁0.3 mL，搖勻靜置6 min，最后加入10%的氫氧化鈉3.0 mL，搖勻靜置15 min。另取70%的乙醇同上操作做空白對照，在最大吸收波長510 nm處測定吸光值。橫坐標(biāo)為蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL），縱坐標(biāo)為吸光度值進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。B=10.216A+0.0734，R2=0.9992，線性范圍：0.0214～0.0713 mg/mL。

1.3.3 五指毛桃總黃酮的測定 精密吸取五指毛桃樣品提取液2.0 mL于10 mL具塞比色管中，同標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制操作方法測定樣品提取液的吸光度值，根據(jù)樣品液的吸光值和標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算總黃酮提取量。五指毛桃中總黃酮提取量的計算：將樣品提取液的吸光度值代入蘆丁回歸方程公式中，可得測定的供試樣品溶液的總黃酮濃度（C），再計算出樣品中的總黃酮提取量。

總黃酮提取量/（mg/100 g）=C×V×N/M×100；

式中：C為粗提取樣液中總黃酮的濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為植物粉末樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗 以液料比20:1、提取時間4 min、提取功率400 W、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%為單因素試驗基礎(chǔ)條件，以五指毛桃總黃酮提取量為指標(biāo)，分別考察4個單因素對五指毛桃總黃酮提取量的影響。其中，液料比分別為10:1、20:1、30:1、40:1、50:1（mL/g）；提取時間分別為1、2、4、6、8 min；提取功率分別為200、300、400、500、600 W；乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%。

1.3.5 五指毛桃總黃酮微波輔助提取工藝條件的優(yōu)化 響應(yīng)面優(yōu)化分析法是一種由數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)二者相結(jié)合并且能夠精準(zhǔn)的表達(dá)響應(yīng)值與各因素之間關(guān)系的常用方法（王永菲等，2005）。本試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過使用處理軟件Design-Expert.V8.0.6設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，從而選出液料比（mL/g）、提取時間（min）、提取功率（W）、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）四個自變量的最優(yōu)值。響應(yīng)面因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

1.4 數(shù)據(jù)分析 所有試驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次取平均值，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析，并用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 五指毛桃黃酮提取的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 液料比對五指毛桃總黃酮提取量的影響由圖1可知，液料比為10:1～20:1（mL/g）時，總黃酮提取量增加，應(yīng)該是隨著溶劑用量的增加，溶劑與五指毛桃粉接觸更充分，總黃酮提取量增大，在20:1時達(dá)到最大值，此后再增加70%乙醇溶劑用量時，總黃酮提取量下降。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)液料比增加到一定值時，會在體系內(nèi)出現(xiàn)與黃酮競爭溶劑的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致總黃酮提取量下降（薛菁等，2017）。故最佳液料比定為20:1（mL/g）。

圖1 液料比對五指毛桃總黃酮提取量的影響

2.1.2 提取時間對五指毛桃總黃酮提取量的影響由圖2可知，總黃酮提取量在1～4 min時，隨著微波時間的增加而增加，可能是因為時間的加長，微波輻射量增加，體系內(nèi)分子加速運(yùn)動，使五指毛桃中的總黃酮加快提出，總黃酮提取量增加，在4 min時提取量到達(dá)最高值，若此時繼續(xù)延長微波提取時間，總黃酮提取量則開始隨時間的加長而下降。原因可能是微波時間過長，使溶劑揮發(fā)過多，也可能是微波輻射過量，溫度過高使五指毛桃中的黃酮被降解，從而總黃酮量下降（秦明有，2018）。故確定最優(yōu)提取時間為4 min。

圖2 提取時間對五指毛桃總黃酮提取量的影響

2.1.3 提取功率對五指毛桃總黃酮提取量的影響由圖3可知，微波功率為200～400 W時，隨著微波功率的增大，總黃酮提取量增加，這可能是因為功率增大，使溶劑與原料充分接觸，利于總黃酮溶解，提出量增加，且到400 W時取得最大值，此時，若微波功率繼續(xù)增大，總黃酮提取量開始下降。原因可能是在微波功率增大的同時，溫度和溶劑的揮發(fā)速度以及總黃酮的降解速度也會隨之加快，使得總黃酮提取量下降（朱新鵬等，2020）。所以取最佳提取功率為400 W。

圖3 提取功率對五指毛桃總黃酮提取量的影響

2.1.4 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對五指毛桃總黃酮提取量的影響 由圖4可知，在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%～70%時，總黃酮提取量隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而提高，在70%時達(dá)到最大值，此時提高乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，總黃酮提取量開始下降。原因可能是當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到一定值后，若繼續(xù)增大會使五指毛桃中的其他脂溶性或色素等雜質(zhì)溶出，從而影響總黃酮的測量，造成總黃酮提取量的下降（陳婷等，2016）。故最佳乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定為70%。

圖4 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對五指毛桃總黃酮提取量的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析與試驗結(jié)果

2.2.1 模型建立與方差分析 以液料比（A）、提取時間（B）、提取功率（C）、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（D）為因素，五指毛桃總黃酮提取量（Y）為指標(biāo)設(shè)計試驗，中心點設(shè)計5個重復(fù)試驗。響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計條件與結(jié)果如表2所示。

用Design-Expert軟件對表2中五指毛桃總黃酮的含量與四因素進(jìn)行回歸方程的擬合。擬合的回歸方程模型為：Y=351.90+0.47A+3.36B+4.06C+3.50D-0.98AB-1.89AC+2.03AD-9.94BC-4.34BD-7.49CD-19.63A2-10.67B2-11.02C2-8.99D2。

表2 響應(yīng)面試驗條件與結(jié)果

通過回歸方程方差分析，可以看出不同的提取因素對五指毛桃黃酮提取量的不同影響程度，結(jié)果如表3所示。

由表3可看出，模型中F=28.03，P＜0.0001，表明該模型極顯著。C、BC、CD、A2、B2、C2、D2差異性極顯著，B、D差異高度顯著，BD差異顯著，其他項不顯著。失擬項（P=0.1299＞0.05）不顯著，表明該模型與試驗值差異較小，該二次回歸方程有意義，因此能較好的進(jìn)行預(yù)測。R2=0.9656，表明該模型擬合程度較好，試驗誤差較??；從F值可看出，在試驗范圍內(nèi)各個單因素對五指毛桃黃酮提取量影響程度大小順序為：提取功率＞乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞提取時間＞液料比。

表3 響應(yīng)面回歸方程的方差分析

2.2.2 響應(yīng)面圖形分析 在響應(yīng)面分析中，可以通過擬合響應(yīng)面值的形狀來分析各變量對響應(yīng)值的影響；等高線形狀可以判斷出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱；曲線圖的陡峭幅度可以表明各因素的影響程度大小主次關(guān)系。在平面直角坐標(biāo)系中用響應(yīng)值五指毛桃總黃酮提取量（Y）與兩個變量繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖，結(jié)果見圖5～10。

從圖5、6、7可以看出，響應(yīng)面等高線圖趨于圓形，且結(jié)合方差分析結(jié)果可知，液料比與提取時間、液料比與提取功率、液料比與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)這3組因素之間交互關(guān)系不顯著。又從三維曲面圖可以看出，提取時間、提取功率、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的坡面均較液料比的坡面陡峭，則說明提取時間、提取功率、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對五指毛桃的總黃酮提取量影響顯著，液料比影響不顯著。

圖5 總黃酮提取量隨液料比與提取時間變化的等高線圖與曲面圖

由圖8、9、10可以看出，響應(yīng)面等高線圖呈橢圓形，且結(jié)合方差分析的結(jié)果可知，提取時間與提取功率、提取時間與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取功率與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)這三組因素之間的交互關(guān)系顯著。從三維曲面圖可以看出，提取功率的坡面較提取時間的坡面陡峭；乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的坡面較提取時間的坡面陡峭；提取功率的坡面較乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的坡面陡峭，則說明提取功率對五指毛桃的總黃酮提取量影響極顯著，提取時間、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響高度顯著。

圖6 總黃酮提取量隨液料比與提取功率變化的等高線圖與曲面圖

圖7 總黃酮提取量隨液料比與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的等高線圖與曲面圖

圖8 總黃酮提取量隨提取時間與提取功率變化的等高線圖與曲面圖

2.3 最優(yōu)工藝參數(shù)的確定 經(jīng)過Design-Expert8.0.6軟件建立響應(yīng)面優(yōu)化分析，可以得到提取五指毛桃總黃酮的最佳工藝條件為：液料比20.12：1（mL/g），提取時間4.16 min，提取功率410 W，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)71.34%，五指毛桃含量的預(yù)測值為352.48 mg/100 g。為了驗證該工藝條件的真實性及讓試驗易于操作，綜合考慮將料液比定為20:1（mL/g），提取時間為4 min，提取功率為400 W，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71%，在此條件下進(jìn)行驗證試驗，重復(fù)試驗3次，其平均值為351.93 mg/100 g，通過計算可知五指毛桃總黃酮提取量的實際值與預(yù)測值的相對誤差為0.087%，誤差較小，這說明該模型具有可信度，優(yōu)化方法可行、操作性較好。

圖9 總黃酮提取量隨提取時間與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的等高線圖與曲面圖

圖10 總黃酮提取量隨提取功率與乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的等高線圖與曲面圖

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，乙醇-微波輔助提取五指毛桃總黃酮最佳工藝條件為：液料比20:1（mL/g），提取時間4 min，提取功率400 W，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)71%。經(jīng)過驗證試驗得五指毛桃總黃酮提取量為（351.93±0.25）mg/100 g，具有一定的可靠性與參考價值，該試驗一定程度上為五指毛桃的后續(xù)開發(fā)與研究提供了依據(jù)與參考價值。