紙莎草的化學(xué)成分研究

段文蘭，婁嘉豪，王 薔，趙紫艷，賴 祺，裴少非，曾廣智，尹俊林

云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院 民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實驗室;云南省高校天然源抗癌藥物靶向遞送研發(fā)重點(diǎn)實驗室，昆明 650500

紙莎草(Cyperuspapyrus)為莎草科(Cyperaceae)莎草屬(Cyperus)植物，是一種高大的水生或水濕生植物。紙莎草又稱紙草、埃及莎草或埃及紙草，原生于歐洲南部、非洲北部以及小亞細(xì)亞地區(qū)，是構(gòu)成較深水中植被的主要植物。紙莎草是古埃及文明的一個重要組成部分，古埃及人利用其制成的書寫載體，曾被歐洲人和阿拉伯人使用，歷3 000年不衰，直至公元8世紀(jì)，中國造紙術(shù)傳到中東取代了莎草紙[1,2]。

紙莎草具有很強(qiáng)的水體凈化功能，多被培育和改良為水體景觀植物[3]。目前國內(nèi)外對紙莎草的研究主要在其水質(zhì)凈化功能方面，關(guān)于其化學(xué)成分的研究不多，生物活性方面除了美白護(hù)膚作用外鮮有報道[4]。紙莎草的同科同屬植物莎草(C.rotundus)的干燥根莖為《中國藥典》收載的常用中藥香附，具有解熱鎮(zhèn)痛和抗炎等活性，臨床常用于治療痛經(jīng)、月經(jīng)失調(diào)和胃腸紊亂等病癥[5]。核因子-κB(NF-κB)是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，它參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答過程，NF-κB信號通路的過度激活，與人類包括癌癥在內(nèi)的多種炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，因此抑制NF-κB信號通路的過度活化，有可能成為相關(guān)疾病的治療手段[6]。為了深入研究紙莎草化學(xué)及活性成分，對紙莎草全株進(jìn)行了研究，從中分離鑒定了19個化合物，并發(fā)現(xiàn)了9個對TNF-α誘導(dǎo)激活的NF-κB信號通路有抑制作用的活性化合物。

1 實驗部分

1.1 植物材料

紙莎草全株由昆明植分生物技術(shù)有限公司于2018年8月采集于昆明馬金鋪，樣品經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)李國棟副教授鑒定為紙莎草的全草(Cyperuspapyrus)，標(biāo)本(YMU-ZF20180917)保存于民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實驗室。

1.2 儀器與試劑

制備、半制備HPLC及LC/MS流動相所用有機(jī)溶劑為色譜級甲醇和乙腈(霍尼韋爾，美國)，水為純凈水(娃哈哈，中國)；其他化學(xué)試劑均為分析純(云南利妍科技，中國)；Sephadex LH-20(GE Healthcare，美國)；柱色譜用MCI GEL CHP20/P120填料(三菱化學(xué)，日本)；薄層色譜硅膠板GF254(青島海洋，中國)；柱色譜用硅膠(60～100、100～200、200～300、300～400目；青島海洋，中國)；顯色劑：10%磷鉬酸-乙醇溶液和茴香醛、10%硫酸-乙醇溶液(105 ℃加熱顯色)、5%硫酸-乙醇溶液、碘；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺(Biological Industries，以色列)；Lipofectamine 2000(ThermoFisher，美國)；地塞米松(Aladdin，中國)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega，美國)。

EYELA N-1100自動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗，中國)；EYELA OSB-2100水浴鍋(上海愛朗，中國)；NP7000泵-NU3000制備液相(江蘇漢邦，中國)；6420 Triple Quad LC/MS(Agilent，美國)；1260 Infinity半制備高效液相色譜(Agilent，美國)；DRX-400和DRX-600型核磁共振儀(Bruker，瑞士)；BS124S型電子分析天平(Sartorius，德國)；Spectra Max i3x型酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國)；5424R型離心機(jī)(Eppendorf，德國)；二氧化碳培養(yǎng)箱(ThermoFisher，美國)；5977 MSD旋光儀(Agilent，美國)。

1.3 實驗方法與步驟

1.3.1 提取與分離

紙莎草(12 kg)干燥樣品粉碎后，用95%甲醇冷浸提取6次，每次48 h，合并提取液，提取液經(jīng)過濾、減壓濃縮后得浸膏1 kg。將提取物浸膏混懸于適量溫水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，合并濃縮液得到石油醚部分浸膏75 g，乙酸乙酯部分浸膏100 g和正丁醇部分浸膏12 g。石油醚部分浸膏(75 g)先用MCI除色素及分離，洗脫梯度為50%、70%、90%、100%甲醇/水，經(jīng)TLC檢測合并相同組分，共得到10個組分，分別記為FrA.1～FrA.10。70%甲醇/水洗脫部分(FrA.4)用60～100目硅膠拌樣進(jìn)行正相硅膠柱色譜分離，洗脫梯度系統(tǒng)為石油醚∶二氯甲烷(1∶0→0∶1)，經(jīng)TLC檢測合并相同組分，共得到5個組分，分別記為A4.1～A4.5。A4.2先后用硅膠[洗脫劑：石油醚∶二氯甲烷(1∶0→25∶1)]及Sephadex LH-20[洗脫劑：甲醇∶二氯甲烷(1∶1)]柱層析分離，得到化合物1(10.5 mg)和7(7 mg)。A4.3先后用硅膠[洗脫劑：石油醚∶二氯甲烷(50∶1→1∶1)]及Sephadex LH-20柱層析[洗脫劑：甲醇∶二氯甲烷(1∶2)]分離純化，得到化合物2(20 mg)和9(10 mg)。70%甲醇/水洗脫部分(FrA.5)用60～100目硅膠拌樣進(jìn)行柱色譜分離，洗脫系統(tǒng)為石油醚∶二氯甲烷 =1∶0→0∶1，經(jīng)TLC檢測合并相同組分，共得到4個組分，分別記為A5.1～A5.4。A5.3先后用硅膠[洗脫劑：石油醚∶二氯甲烷(25∶1→1∶1)]與Sephadex LH-20柱層析(洗脫劑：甲醇)分離純化，得到化合物3(8 mg)和4(9 mg)。90%甲醇/水洗脫部分(FrA.8)用制備高效液相色譜[洗脫劑：甲醇∶水(68∶32)，流速8.0 mL/min]進(jìn)行色譜分離，共得到5個組分，分別記為A8.1～A8.5。A8.3先后用硅膠 [洗脫劑：石油醚∶二氯甲烷(25∶1→5∶1)]與Sephadex LH-20柱層析[洗脫劑：甲醇∶二氯甲烷(1∶1)]分離純化，得到化合物5(22.5 mg)、6(10 mg)和8(8 mg)。乙酸乙酯部分浸膏(100 g)先用MCI除色素及分離，洗脫梯度系統(tǒng)為50%、70%、90%、100%甲醇/水，經(jīng)TLC檢測合并相同組分，共得到8個組分，分別記為FrB.1～FrB.8。70%甲醇/水部分(FrB.4)用60～100目硅膠拌樣進(jìn)行柱色譜分離，洗脫梯度系統(tǒng)為石油醚∶乙酸乙酯(1∶0→0∶1)，經(jīng)TLC檢測合并相同組分，共得到5個組分，分別記為B4.1～B4.5。B4.2先后用硅膠 [洗脫劑：石油醚∶乙酸乙酯(50∶0→1∶1)]與Sephadex LH-20 柱層析 [洗脫劑：甲醇∶二氯甲烷(1∶1)]分離純化，得到化合物11(14 mg)和19(23 mg)。B4.3先后用硅膠柱層析 [洗脫劑：二氯甲烷∶甲醇(100∶1→10∶1)]和半制備高效液相色譜 [洗脫劑：甲醇∶水 =70∶30，流速為1.0 mL/min]進(jìn)行色譜分離純化，分別得到化合物10(18 mg，tR=35 min)和14(14 mg，tR=40 min)。B4.4先后用硅膠[洗脫劑：石油醚∶二氯甲烷(25∶1→1∶1)]與Sephadex LH-20柱層析(洗脫劑：甲醇)分離純化，得到化合物15(15 mg)。90%甲醇/水部分(FrB.7)用60～100目硅膠拌樣進(jìn)行柱色譜分離，洗脫梯度系統(tǒng)為石油醚∶乙酸乙酯(1∶0→0∶1)，經(jīng)TLC檢測合并相同組分，共得到6個組分，分別記為B7.1～B7.6。B7.3先后用硅膠[洗脫劑：石油醚∶乙酸乙酯(50∶0→1∶1)]與Sephadex LH-20柱層析[洗脫劑：甲醇∶二氯甲烷(1∶1)]分離純化，得到化合物12(12 mg)。B7.4先后用硅膠柱層析[洗脫劑：二氯甲烷∶甲醇(100∶1→25∶1)]、Sephadex LH-20柱層析 [洗脫劑：甲醇∶二氯甲烷(1∶1)]和半制備高效液相色譜[洗脫劑：甲醇∶水 =60∶40，流速為1.0 mL/min]進(jìn)行色譜分離純化，分別得到化合物13(10 mg，tR=30 min)和16(8 mg，tR=36 min)。B7.5先后用硅膠柱層析[洗脫劑：石油醚∶二氯甲烷(25∶1→1∶1)]與Sephadex LH-20(洗脫劑：甲醇)分離純化，得到化合物17(20 mg)和18(10 mg)。

1.3.2 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

參照前期的實驗方法[7]：將HEK293T細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并放置于37 ℃，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。細(xì)胞接種于24孔板中24 h后，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染pNF-κB-luc和pRL-TK質(zhì)粒后繼續(xù)培養(yǎng)18 h，加入不同濃度的待測化合物孵育4 h后加入10 ng/mL TNF-α再繼續(xù)培養(yǎng)4 h。之后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測化合物1～19對NF-κB信號通路活性的影響。

2 實驗結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物15無色液體;分子式為C18H32O2，分子量280。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.35(4H，m，H-9，H-10，H-12，H-13)，2.78(2H，t，J=6.4 Hz，H-11)，2.36(1H，t，J=7.2 Hz，H-2)，2.04(4H，m，H-8，H-14)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：179.5(C-1)，130.2(C-12)，130.0(C-10)，129.7(C-13)，128.0(C-9)，34.0(C-2)，31.9(C-16)，31.5(C-6)，29.7(C-7)，29.2(C-15)，27.2(C-8、C14)，25.6(C-11)，24.7(C-3)，22.7(C-17)，14.1(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報道數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物15為順，順-9，12-十八(碳)二烯酸。

化合物16無色油狀物;分子式為C17H34O2，分子量270。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.66(3H，s，H-17)，2.31(2H，t，J=7.5 Hz，H-2)，1.62(2H，q，J=7.5 Hz，H-3)，1.25(24H，m，H-4～H-15)，0.89(3H，t，J=6.7 Hz，H-16)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：175.8(C-1)，49.3(-OMe)，33.2(C-2)，30.9(C-14)，28.7(C-8、C-10、C-12)，28.6(C-7)，28.5(C-6)，28.4(C-9、C-11、C-13)，28.3(C-5)，28.2(C-4)，24.0(C-3)，21.7(C-15)，13.1(C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報道數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物16為棕櫚酸甲酯。

化合物17無色油狀物;分子式為C28H56O2，分子量424。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：2.36(2H，m，H-2)，1.62(2H，m，H-3)，1.25(48H，m，H-4～H-27)，0.89(3H，m，H-28)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：178.1(C-1)，32.9(C-2～C-18)，30.9(C-19)，28.7(C-20)，28.6(C-21)，28.4(C-22)，28.3(C-23)，28.2(C-24)，28.1(C-25)，23.7(C-26)，21.7(C-27)，13.1(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報道數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物17為正二十八烷酸。

化合物19白色固體;分子式為C19H36Cl2O2，分子量366。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.51(3H，s，H-19)，2.16(2H，m，H-2)，3.89(2H，m，H-9，H-10)，1.41～1.11(26H，m，H-3～H-8，H-11～H-17)，0.81(3H，s，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：174.1(C-1)，64.4(C-9、C-10)，51.5(-OMe)，34.4(C-8、C-11)，34.1(C-2)，31.9(C-16)，29.7(C-15)，29.5(C-5)，29.4(C-4)，29.3(C-6)，29.2(C-14)，28.7(C-13)，26.0(C-7、C-12)，25.1(C-3)，22.7(C-17)，14.1(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報道數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物19為9,10-二氯-十八烷酸甲酯。

2.2 NF-κB通路抑制活性

雙熒光素酶報告基因檢測法考察了化合物1～19對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞中NF-κB信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)化合物1、2、3、5、6、10、12、13和16在最高100 μM濃度下對TNF-α誘導(dǎo)激活的NF-κB信號通路有抑制作用，半數(shù)抑制濃度(IC50)值在34.96～98.23 μM之間，其中桉烷型倍半萜化合物6活性最強(qiáng)，IC50值為34.96 ± 0.61 μM(見表1)。

表1 化合物對TNF-α活化的NF-κB通路的抑制活性

3 討論與結(jié)論

對紙莎草的化學(xué)及活性成分進(jìn)行了研究，從其甲醇提取物中分離得到了19個化合物，化合物類型包括倍半萜(1～6)、甾體(7～14)和脂肪酸(15～19)，所有化合物均為首次從紙莎草中分離得到，豐富了紙莎草及莎草屬植物的化學(xué)成分研究。通過抗炎活性研究，發(fā)現(xiàn)了9個對TNF-α誘導(dǎo)激活的NF-κB信號通路有抑制作用的活性化合物，活性化合物主要為倍半萜和甾體類化合物，其中倍半萜類化合物活性較強(qiáng)，尤其是桉烷型倍半萜(1和6)，這與我們前期關(guān)于其同屬植物莎草的研究結(jié)果一致[7]。莎草屬植物中富含倍半萜類成分[8,10,11]，我們的研究發(fā)現(xiàn)，倍半萜類成分是紙莎草中具有潛在抗炎作用的活性成分，尤其是桉烷型倍半萜。為了合理開發(fā)利用該植物資源，有必要對紙莎草中的活性成分開展進(jìn)一步的系統(tǒng)研究，深入探討其活性機(jī)理及開展其體內(nèi)活性驗證。本研究為后續(xù)關(guān)于紙莎草及莎草屬植物的生物活性研究提供了物質(zhì)及理論支持。