甘蔗組培苗2種污染細(xì)菌的分離與鑒定

劉紅堅(jiān) 李松 何為中 劉俊仙 劉麗敏 盧曼曼 游建華 黃誠華 林善海

摘 ?要：細(xì)菌污染是甘蔗組培苗生產(chǎn)上的一個(gè)主要問題。為明確甘蔗組培中常出現(xiàn)的污染細(xì)菌的種類，本研究通過梯度稀釋的方法分離污染細(xì)菌，結(jié)合生化特性、16S rRNA和phaC基因序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定其分類地位。結(jié)果表明，共分離獲得2種不同類型污染細(xì)菌，除了甘露醇，其余9個(gè)生化指標(biāo)完全一致?；蛐蛄斜葘?duì)發(fā)現(xiàn)，2種類型分離物的種內(nèi)2個(gè)基因序列完全一致，而種間16S rRNA序列只有2個(gè)堿基差異，種間phaC序列有23個(gè)堿基差異。2個(gè)基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，2種細(xì)菌遺傳距離較近，并均能形成獨(dú)立的2個(gè)分支。結(jié)合生化特征、序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹，將2種污染細(xì)菌分別鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）和阿氏芽孢桿菌（B. aryabhattai），且首次報(bào)道阿氏芽孢桿菌為甘蔗組織培養(yǎng)中的污染細(xì)菌。本研究揭示了巨大芽孢桿菌可能來源于甘蔗的內(nèi)生菌，而阿氏芽孢桿菌來源于環(huán)境。

關(guān)鍵詞：甘蔗;組培苗;污染細(xì)菌;芽孢桿菌;系統(tǒng)發(fā)育樹

Abstract： Contamination is a main issue in sugarcane tissue culture. The purpose of this study was to determine the contaminative bacteria frequently occurred during the production of sugarcane tissue culture. The gradient dilution method was used to isolate bacteria， and the toxonomic position was identified combining the biochemical， sequence alignment of 16S rDNA and phaC genes， phylogeomic analysis. The results showed that two type contaminative bacteria were obtained from the sugarcane tissue culture nutrient solution， and nine tested biochemical characters were the same between the two bacteria except mannitol utilization. Sequence alignment showed that intraspecific sequences of 16S rDNA and phaC genes were completely uniformity respectively in the two bacteria， but the difference of the two nucleotide bases in 16S rDNA and 23 in phaC sequences existed between the two bacteria. The phylogenic tree constructed based on 16S rDNA and phaC genes sequences respectively also indicated that the two bacteria were closest each other and clustered into two absolutely independent branches. Combining the biochemical characters， sequence alignment and phylogenetic analysis， the two contaminative bacteria were identified as Bacillus megaterium and B. aryabhattai， respectively. This is the first report of B. aryabhattai as the contaminative bacterium in sugarcane tissue culture. This study revealed that B. megaterium probably came from endophyte and B. aryabhattai from environment.

Keywords： sugarcane; tissue culture seedling; contaminative bacterium; Bacillus; phylogenetic tree

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是熱帶和亞熱帶氣候種植的重要經(jīng)濟(jì)作物之一，占全球產(chǎn)糖量的80%左右。甘蔗在廣西農(nóng)業(yè)、工業(yè)作物中占據(jù)了極其重要的位置。許多工業(yè)和工廠都依賴于甘蔗及其副產(chǎn)品提供的原材料。它被認(rèn)為是將太陽能轉(zhuǎn)化為有價(jià)值且可應(yīng)用的化學(xué)能的主要作物之一，如蔗糖和生物質(zhì)。甘蔗主要通過種莖進(jìn)行無性繁殖，但長年無性繁殖容易引起線蟲、真菌、細(xì)菌和病毒等引起的系統(tǒng)性病害，導(dǎo)致種性退化、產(chǎn)量損失[1-2]。組織培養(yǎng)技術(shù)因?yàn)榉N苗質(zhì)量在遺傳變異方面保持穩(wěn)定，可得到無病害植株，生產(chǎn)時(shí)間相對(duì)較短，土地需求量低，加速植物繁殖等優(yōu)點(diǎn)而成為甘蔗繁殖的最佳方法[3-5]。

微生物污染是影響甘蔗體外培養(yǎng)的主要障礙。污染的主要來源是植物組織上的內(nèi)生和附生微生物、培養(yǎng)基中的空氣污染物、組織培養(yǎng)工作中處理不良的污染物等[6]。因此，對(duì)甘蔗污染的微生物進(jìn)行分離、鑒定，是進(jìn)一步提高組織培養(yǎng)快速繁殖的重要基礎(chǔ)。在植物組織培養(yǎng)中，污染菌主要包括真菌、細(xì)菌和酵母三大類，而細(xì)菌引起的污染最嚴(yán)重。前人已經(jīng)報(bào)道了很多污染植物組培苗的細(xì)菌，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和乳酸菌屬（Lactobacillus）等多個(gè)屬的細(xì)菌污染頻率最高[7-8]。目前已報(bào)道的甘蔗組培苗污染細(xì)菌有人蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropi）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢桿菌（B. mega terium）、短小芽孢桿菌（B. pumillus）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、嗜麥芽黃單胞菌（Xanthomonas maltophilia）、唐菖蒲伯克霍爾德菌（Burkholderia gladioli）以及腸桿菌科（Enterobacteriacea）的一些種[9-12]。近年來，隨著甘蔗種植良種化、標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程的推進(jìn)，甘蔗健康種苗需求量不斷上升。而細(xì)菌污染是影響組培苗工廠化生產(chǎn)最主要的限制因素之一。組培苗的污染微生物種類主要與環(huán)境有較大的關(guān)聯(lián)[6]，國外對(duì)組培苗污染微生物已開展了很多研究，但國內(nèi)鮮有報(bào)道，主要集中在組培苗污染的防控方面。因此，有必要對(duì)甘蔗組培苗生產(chǎn)過程中常見的污染細(xì)菌種類進(jìn)行分離鑒定。從實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)組培苗過程各個(gè)環(huán)節(jié)中收集常見的細(xì)菌污染樣本，通過分離、純化，并進(jìn)行生理生化及分子鑒定，為后期制定合理的防控措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?污染材料

在實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的‘桂糖44號(hào)‘桂糖46號(hào)‘桂糖47號(hào)‘桂糖48號(hào)等4個(gè)品種甘蔗組培苗中挑選培養(yǎng)基渾濁的樣本，觀察和記錄污染癥狀、顏色及類型。為了排除單一污染源的影響，從組培室中收集了不同接種時(shí)間、不同操作人員、不同超凈臺(tái)的各種污染形態(tài)的培養(yǎng)物，根據(jù)污染的顏色、組培苗的大小分成三大組，每組10瓶培養(yǎng)物。再根據(jù)相同污染顏色、不同時(shí)期各選取3瓶，分為A組和B組。

1.2 ?污染菌株分離

通過對(duì)腐爛組織塊及培養(yǎng)基進(jìn)行研磨處理，把樣品均質(zhì)化，保證污染的組培物表面及內(nèi)部的污染菌都會(huì)得到分離培養(yǎng)。通過梯度稀釋，采用劃線單菌落的方法進(jìn)行分離純化。以每瓶為1個(gè)樣本，在超凈臺(tái)中各取少量組培苗組織于2 mL無菌EP管中，用快速組織冷凍研磨儀（JXFSTPRP-CL，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）對(duì)組織塊進(jìn)行低速研磨，得到均質(zhì)組織后，加入1 mL滅菌水，振蕩混勻，混合液稀釋103倍，各取10 μL涂布LA培養(yǎng)基平板（8 g NaCl，8 g胰蛋白胨，4 g酵母提取物，12 g瓊脂，1 L dH2O），每個(gè)樣本涂布3個(gè)平板，于28?℃倒置培養(yǎng)。挑取形態(tài)不同的單菌落于新的LA培養(yǎng)基平板中劃線培養(yǎng)，經(jīng)3次以上分離純化最終得到純化菌株。

1.3 ?生化鑒定

挑取每個(gè)分離物平板上的單菌落至2 mL無菌生理鹽水的試管中，用移液器混勻菌落制成菌懸液，然后往生化鑒定條中每孔加入100 μL的菌懸液，36?℃培養(yǎng)24～72 h。根據(jù)每種生化鑒定的特點(diǎn)，進(jìn)行判斷每個(gè)菌株的生化分解能力。采用生化鑒定管（青島海博）鑒定的10種生化指標(biāo)包括硝酸鹽利用能力、淀粉水解能力、西蒙氏檸檬酸鹽利用能力、葡萄糖蛋白胨分解能力（MR-VP）、葡萄糖利用能力、甘露醇利用能力、溶菌酶實(shí)驗(yàn)、動(dòng)力實(shí)驗(yàn)、明膠水解能力、過氧化氫分解能力。具體操作方法見產(chǎn)品說明書。

1.4 ?DNA提取

挑取分離純化后的單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基（8 g NaCl，8 g胰蛋白胨，4 g酵母提取物，1 L dH2O）中，37?℃震蕩培養(yǎng)至OD600=2.0。取1?mL菌液，8000 r/min離心1 min，去除上清培養(yǎng)基，加入1 mL無菌水進(jìn)行洗滌，8000 r/min離心1 min，去除上清得到菌體。使用博日科技細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Biospin， #BSC12S1）按照說明書進(jìn)行菌株基因組DNA提取。瓊脂糖核酸電泳進(jìn)行所得基因組DNA完整度檢測(cè)，NanoDrop ND-2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀（美國NanoDrop公司）檢測(cè)OD260/280后進(jìn)行評(píng)估DNA純度檢測(cè)。

1.5 ?16S rRNA基因鑒定

16S rRNA基因擴(kuò)增引物為：27F： 5-GAGTTT GATCCTGGCTCAG-3和1492R： 5-GTTACCTTG TTACGACTT-3[13]。PCR反應(yīng)條件為：94?℃變性5 min，94?℃ 30 s、65?℃ 30 s、72?℃ 30 s擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72?℃延伸5 min。預(yù)期的PCR產(chǎn)物片段長度為1 465 bp。通過1.0%濃度的瓊脂糖核酸電泳檢測(cè)后，使用ABI Genetic Analyzer 3730xl（Applied Biosystems）進(jìn)行Sanger測(cè)序（南寧國拓生物科技有限公司）。獲得的序列使用Vector NTI 11.0軟件（Invitrogen）進(jìn)行Assemble拼接，所得的Contigs序列采用BLAST軟件（https：//blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對(duì)分析。

1.6 ?phaC基因PCR擴(kuò)增與測(cè)序

phaC基因擴(kuò)增引物為BmphaC015F： 5-CGT GCAAGAGTGGGAAAAAT-3和BmphaC931R： 5- TCGCAATATGATCACGGCTA-3[14]，反應(yīng)條件為：94?℃變性5 min，94?℃ 1 min、63.9?℃ 1 min、72?℃ 2 min 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72?℃延伸5 min。預(yù)期的PCR產(chǎn)物片段長度為0.9 kb，通過1.0%濃度的瓊脂糖核酸電泳檢測(cè)后，進(jìn)行克隆雙向Sanger測(cè)序。

1.7 ?進(jìn)化分析

用于進(jìn)化分析的序列包括經(jīng)測(cè)序所得菌株的16S rRNA和phaC基因序列，其他用于建樹的序列均來自美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。使用CLUSTALW軟件進(jìn)行序列比對(duì)，使用Mega ediors對(duì)序列進(jìn)行編輯。使用MEGA 4.0軟件，采用NJ（Neighbor Joining）和ME（Minimum Evolution）算法，分別構(gòu)建16S rRNA和phaC基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，自展值（Bootstrap值）選擇為1000，檢驗(yàn)所計(jì)算的進(jìn)化樹分支可信度。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?污染癥狀及菌落形態(tài)

被細(xì)菌污染的組培苗培養(yǎng)液渾濁，組培苗生長受到不同程度影響，污染輕的造成組培苗生長羸弱，葉片黃綠色，先長出來的葉片發(fā)黃、腐爛，污染嚴(yán)重的直接造成愈傷組織或組培苗死亡。從污染培養(yǎng)液看，2種菌均呈淺橘紅色，A組污染的顏色較淺，菌液較為透明些，有棉絮狀的菌苔形成（圖1A）;而B組污染的顏色較深，菌液均勻，無棉絮狀菌苔形成（圖1B）;健康的組培苗培養(yǎng)液清澈，組培苗或愈傷組織生長良好，葉片濃綠（圖1C）。在稀釋涂布的平板中，2種菌株的菌落均呈圓形、突起、表面光滑、有光澤、粘稠，在表型上均非常相似，形態(tài)上無明顯差異（圖1D，圖1E）。

2.2 ?分離菌株生化鑒定

單株分離A組獲得17株細(xì)菌，B組獲得5株細(xì)菌。從A組和B組分別挑取3株作為代表菌株用于生化指標(biāo)測(cè)定及后續(xù)的分子鑒定。從測(cè)試的10種生化指標(biāo)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從甘蔗污染組培苗中分離的A、B 2組菌株，其組內(nèi)各菌株的生化指標(biāo)完全一致。A組的甘露醇均為陽性，而B組菌株均為陰性，其余9個(gè)生化指標(biāo)完全相同，說明這些菌株相似度很高（表1）。從生化特征初步判斷A組菌株為巨大芽孢桿菌（B. megaterium），B組菌株為阿氏芽孢桿菌（B. aryabhattai）。

2.3 ?分子鑒定及序列分析

6株菌株經(jīng)16S rDNA序列PCR擴(kuò)增所得片段約為1.4 kb（圖2A），phaC基因PCR擴(kuò)增獲得片段約0.9 kb（圖2B）。將測(cè)序獲得的序列進(jìn)行了BLAST比對(duì)分析（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）。比對(duì)結(jié)果顯示，6個(gè)菌株均與B. megaterium、B. aryabhattai具有較高的同源性。A組菌株的16S rDNA序列與B. megaterium KNU-01（CP041066）相似度最高（100%）;B組菌株的16S rDNA序列與B. aryabhattai S22（MN062621）相似度最高（100%）。而A組菌株的phaC序列與B. megaterium SF4（KY855378）相似度最高（99%）;B組菌株的phaC序列與B. aryabhattai KNU10（CP041519）相似度最高（99%）。

將6個(gè)菌株序列進(jìn)一步比對(duì)分析顯示，6個(gè)菌株的16S rDNA基因片段同一個(gè)組內(nèi)的菌株序列完全一致，只在904 bp和1007 bp的2個(gè)堿基上有差異，其中A組菌株分別為A和T，而B組菌株為G和C（圖3）。6個(gè)菌株的phaC基因片段同一個(gè)組內(nèi)的菌株序列也完全一致，但A組和B組之間出現(xiàn)23個(gè)堿基的差異（圖4），說明2組菌株之間在phaC基因序列上的遺傳關(guān)系差異較為顯著。將6個(gè)菌株登記在GenBank數(shù)據(jù)庫，分別獲得A1、A2、A3、B1、B2、B3菌株的16S rDNA序列登記號(hào)為MT026568、MT026569、MT026570、MT026571、MT026572、MT026573，phaC基因的登記號(hào)為MT052024、MT0520245、MT052026、MT052027、MT052028、MT052029。

2.4 ?遺傳分析

為了進(jìn)一步區(qū)分2組菌株的遺傳關(guān)系，分別用16S rDNA和phaC基因序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。進(jìn)化樹使用NJ法（Neighbor-joining），自展值（Bootstrap值）為1 000。在以16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，芽孢桿菌屬（Bacillus）的所有菌株與其他屬的細(xì)菌明顯形成不同的分支，A組菌株與巨大芽孢桿菌（B. megaterium）形成一個(gè)獨(dú)立的分支，B組菌株與阿氏芽孢桿菌（B. aryabhattai）形成一個(gè)獨(dú)立的分支，2個(gè)種具有較為相近的遺傳關(guān)系（圖5）。A、B 2組菌株的分類地位在以phaC基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹與16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹具有較高的一致性，A組菌株與巨大芽孢桿菌（B. megaterium）形成一個(gè)獨(dú)立的分支，B組菌株與阿氏芽孢桿菌（B. aryabhattai）形成一個(gè)獨(dú)立的分支（圖6）。2個(gè)基因片段分別構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的一致性進(jìn)一步證明了2種甘蔗組培苗污染細(xì)菌的分類地位。

3 ?討論

甘蔗組培苗污染細(xì)菌種類方面的報(bào)道較少，Klayraung等[9]利用間歇浸沒式方法（temporary immersion bioreactor system， TIBS）研究了甘蔗和水稻組培苗的污染細(xì)菌情況，結(jié)果表明不同植物種類、不同容器大小的細(xì)菌數(shù)量、種群均不一樣。其中使用20 L的TIBS容器時(shí)甘蔗的污染細(xì)菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquifaciens）、短小芽孢桿菌（B. pumilus）和枯草芽孢桿菌（B. subtilis），但使用70 L的TIBS容器時(shí)，污染細(xì)菌為甲基營養(yǎng)細(xì)菌（Methylobacterium sp.）、類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas sp.）。而Moutia等[10]采用蔗芽經(jīng)過表面消毒后培養(yǎng)獲得了13個(gè)污染細(xì)菌菌株，分別為4個(gè)芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株（B. cereus、B. megaterium、B. pumilus和B. subtilis）、7個(gè)腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、嗜麥芽黃單胞菌（Xanthomonas maltophilia）和唐菖蒲伯克霍爾德菌（Burkholderia gladioli）。Yelenys等[11]也首次報(bào)道了人蒼白桿菌（Ochrobactrum anthropi）為甘蔗組培苗的污染細(xì)菌。目前除了甘蔗組培苗，未見巨大芽孢桿菌（B. megaterium）在任何植物的組培苗上有污染的報(bào)道，也未見阿氏芽孢桿菌（B. aryabhattai）在任何植物組培苗有污染的報(bào)道。

芽孢桿菌是組培苗污染菌中最常見的一類細(xì)菌，除了環(huán)境，植物內(nèi)生菌是主要的來源。巨大芽孢桿菌是甘蔗等多種植物中常見的內(nèi)生細(xì)菌，且部分菌株對(duì)甘蔗[10]、南苜蓿[15]、巴拉圭茶[16]和麻瘋樹[17]等植物的生長具有促進(jìn)作用。而已報(bào)道的阿氏芽孢桿菌主要來源于植物的根際土壤[18-20]。目前，尚無阿氏芽孢桿菌作為甘蔗內(nèi)生菌的報(bào)道。說明甘蔗組培苗污染細(xì)菌中巨大芽孢桿菌很有可能是來源于甘蔗的內(nèi)生菌，而阿氏芽孢桿菌來源于環(huán)境。

生理生化特征是鑒定細(xì)菌種屬的一個(gè)重要手段。盡管巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌2個(gè)種進(jìn)化關(guān)系上較為相近，但也存在磷酸酶、脂酶、甲基紅、V-P測(cè)定、甘露醇產(chǎn)酸、苯丙氨酸脫氨酶、脲酶和精氨酸脫氫酶等生理生化特性的差異[21-23]。但也有研究表明這2個(gè)種的脂酶、甲基紅、V-P等生化指標(biāo)存在差異[21， 22， 24]，且同一個(gè)種內(nèi)的不同菌株也有一些指標(biāo)上的差異[14]。因此，即使同一個(gè)種，由于來源不同而具有豐富的遺傳多樣性。本研究對(duì)6個(gè)測(cè)試菌株開展了10個(gè)重要的生化指標(biāo)測(cè)定，雖然未檢測(cè)脂酶、甲基紅2個(gè)指標(biāo)，但其余指標(biāo)的結(jié)果與前人[23]的報(bào)道基本一致。此外，脂肪酸組成和基因組DNA的G+C含量與模式菌株的比較也可作為鑒別2個(gè)種的一個(gè)分類手段[21， 22， 25]。

巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌是細(xì)胞形態(tài)上非常相近、通過BLAST同源性比對(duì)以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹也較難區(qū)分的2個(gè)種[26]。本研究結(jié)果顯示，從16S rDNA和phaC基因序列的進(jìn)化樹分析，A組和B組菌株均被聚集到了同一個(gè)簇中，并與芽孢桿菌屬其他種明顯分開，也說明了巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌之間的進(jìn)化關(guān)系較近。但是2個(gè)基因序列分別構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹均能使2個(gè)種分開并形成獨(dú)立的分支，證明2個(gè)種雖然遺傳距離較近，但還是存在差異。Rao等[21]通過對(duì)巨大芽孢桿菌（DSM 32T）和阿氏芽孢桿菌（DSM 21047T）2個(gè)菌株形態(tài)學(xué)、生化指標(biāo)、基因組系統(tǒng)發(fā)育樹及全基因組分析，均具有較高的一致性，并建議將阿氏芽孢桿菌重新分類為巨大芽孢桿菌的異名種。盡管如此，2個(gè)菌株在堿性磷酸酶、亮氨酸酰胺酶、纈氨酸胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶等多個(gè)表型性狀上卻是相反的。說明2個(gè)種雖然具有較為相近的遺傳性狀，但還是存在多方面的差異特性。本研究結(jié)果表明，2種細(xì)菌的16S rDNA基因序列僅有2個(gè)堿基的差異，通過BLAST比對(duì)分析，2個(gè)基因片段均與2個(gè)菌的同源性較高。為了進(jìn)一步在種的層面上鑒定這些分離物，我們用更具有堿基分辨率的phaC基因進(jìn)行這些分離菌株的進(jìn)化分析，目前PHA合酶C（phaC）基因被廣泛應(yīng)用于鑒定芽孢桿菌屬內(nèi)種[14， 27， 28]。從phaC基因序列比對(duì)結(jié)果顯示，2種細(xì)菌種內(nèi)堿基序列分別具有高度的一致性，而種間堿基序列則具有23個(gè)堿基的差異。說明phaC基因能較好地區(qū)分這2個(gè)種。

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