多肉植物紅司（Echeveria nodulosa）花粉離體萌發(fā)和花粉管生長特性研究

楊瀾 張朝君 杜致輝 陳之林

摘 ?要：以10%蔗糖+0.5%瓊脂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用花粉離體萌發(fā)法研究硼酸濃度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對多肉植物紅司（Echeveria nodulosa）花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響。結(jié)果表明：硼酸濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間三因素以及相互間的交互效應(yīng)對花粉萌發(fā)率的影響差異極顯著;硼酸濃度、培養(yǎng)溫度以及二者間的交互效應(yīng)對花粉管伸長的影響顯著，而培養(yǎng)時間對花粉管伸長的影響不顯著。12～28?℃有利于提高花粉管萌發(fā)率，20～36?℃有利于花粉管的伸長。三因素交互效應(yīng)顯示：60?mg/L硼酸+12?℃+16?h為紅司花粉萌發(fā)最佳條件，萌發(fā)率為52.43%。30 mg/L硼酸+36?℃+16?h為花粉管生長適宜條件，花粉管平均長度達527.74 μm。

關(guān)鍵詞：多肉植物;紅司;培養(yǎng)溫度;花粉管生長

Abstract： Using the in vitro pollen germination method to study the effects of boric acid concentration， temperature and time on the pollen germination and pollen tube growth of succulent plant Echeveria nodulosa， 10% sucrose+0.5% agar was the basic medium. The effects of boric acid， culture temperature， culture time and interaction effects of the three factors on the pollen germination rate had significant differences. The effects of boric acid， culture temperature and interaction effects between them on the pollen tube elongation were significantly different. Culture temperature had no significant effect on pollen tube growth. 12?28?℃ was good for improving the germination rate of pollen tube， and 20?36?℃ was better for the elongation of pollen tube. The three-factor interaction effects showed that 60?mg/L boric acid+12?℃+16 h was the best condition for the pollen germination of E. nodulosa， with a germination rate of 52.43%. 30?mg/L boric acid+36?℃+16 h was the suitable condition for the pollen tube growth.

Keywords： succulents; Echeveria nodulosa; culture temperature; pollen tube growth

多肉植物紅司（Echeveria nodulosa）屬于景天科（Crassulaceae）擬石蓮屬（Echeveria）原生種，原產(chǎn)于墨西哥，葉片上分布著奇特的紅色紋路，花粉量豐富，花期5—7月。紅司能較好適應(yīng)高低溫環(huán)境，且觀賞性較好，引進國內(nèi)后進行大量的商品化生產(chǎn)。在育種方面，紅司也是一種重要的育種父本材料，曾育出園藝品種E. shaviana× E. nodulosa和E.setosa var. ciliata×E. nodulosa。擬石蓮屬是景天科中最具有代表性的一個屬，其種類比例占到景天科原種的97%，而分布在墨西哥的擬石蓮屬多肉植物擁有豐富的多樣性，85%的物種生長在墨西哥[1-2]。此外，擬石蓮屬多肉植物的形態(tài)特征具有較高的吸引力，被世界園藝家和收藏家認為是觀賞價值很高的園藝植物。

González-Mancera等[1]通過電鏡掃描擬石蓮屬花粉，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)品種花粉表現(xiàn)出相似的特征，大小為27～42?m，外形為球狀或橢圓形，表面具有網(wǎng)狀或條形紋飾，但有一些表現(xiàn)出不同的特征，如花粉表面具有孔溝或多個萌發(fā)孔。Jimeno-Sevilla等[3]研究發(fā)現(xiàn)擬石蓮屬植物E.?rosea具有一種特殊的蜂鳥授粉系統(tǒng)，在自然條件下可以獲得較高的結(jié)果率。但實際上擬石蓮屬的多肉植物被園藝家引種栽培在室內(nèi)，缺少有效的傳粉者，自花授粉結(jié)實率普遍較低，只能采取人工輔助授粉方式對其進行遺傳改良，形成具有較高觀賞價值的園藝新品種。人工授粉的方式可有效提高育種成功率，Parra-Tabla等[4]研究發(fā)現(xiàn)人工授粉E. gibbiflora產(chǎn)生的種子比自然授粉多1.74倍?；ǚ刍盍κ怯绊懭斯な诜鄢晒Φ年P(guān)鍵因素之一，而植物的遺傳起源是影響花粉活力的重要因素，突變體或種間雜交高度不育[2]。低活力的花粉會影響雜交中可存活種子的數(shù)量，只有高活力的花粉在柱頭上才有較高的萌發(fā)率，能快速伸長到達子房成功完成受精，是人工輔助授粉及雜交授粉的重要保障，因此，研究花粉的活力對育性和結(jié)實率具有重要意義[5-6]。在研究花粉活力的過程中，離體萌發(fā)法被認為是檢測花粉活力快速、可靠且穩(wěn)定的方法，檢測結(jié)果與在柱頭上的花粉活力相似[7]。本研究為了摸清多肉植物紅司花粉活力及花粉管生長特性，以便育種上能更加高效地運用紅司培育新品種，采用離體萌發(fā)法研究硼酸濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間三因素及其相互間的交互效應(yīng)對于紅司花粉萌發(fā)率及花粉管生長的影響，以期篩選出花粉萌發(fā)及花粉管生長的最佳培養(yǎng)條件，揭示紅司花粉育性，從而提高育種效果和加速育種過程，并為多肉植物育種方提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料紅司為2015年引種種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所多肉種質(zhì)資源保育棚。取樣植株的種植年限為4年，選取發(fā)育正常、長勢健壯、無病蟲害且生長情況接近的紅司5株，并分別編號為1～5號，插上標簽。取材時間為2019年7月，晴天早上9：00—10：00之間，分別采集1～5號紅司植株花朵，每株植株采集5朵，采集的花粉均為花朵剛開放且柱頭出現(xiàn)粘液時期的花粉。

1.2 ?方法

1.2.1 ?花粉離體培養(yǎng) ?用鑷子將花粉輕輕剝落至滴有蒸餾水的離心管中混勻制成懸浮液。以0.5%瓊脂（Agar）+10%蔗糖（Sucrose）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的硼酸，制成的培養(yǎng)基倒入玻璃培養(yǎng)皿中冷卻凝固。分別取100??L的花粉懸浮液滴入固體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行不同處理的暗培養(yǎng)。將培養(yǎng)基置于顯微鏡進行觀察，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率和測量花粉管長度。空白對照CK為0.5%瓊脂（Agar）+10%蔗糖（Sucrose）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，滴入花粉懸浮液后不培養(yǎng)直接觀察。

1.2.2 ?硼酸濃度設(shè)置 ?變量因素A為硼酸。分別添加A1（0 mg/L）、A2（30 mg/L）、A3（60 mg/L）、A4（100 mg/L）4種濃度水平的硼酸。

1.2.3 ?培養(yǎng)溫度設(shè)置 ?變量因素B為培養(yǎng)溫度，設(shè)定為5種水平，設(shè)計覆蓋了低中高3個溫區(qū)，分別是B1（12?℃）、B2（20?℃）、B3（28?℃）、B4（36?℃）、B5（44?℃）。

1.2.4 ?培養(yǎng)時間設(shè)置 ?變量因素C為培養(yǎng)時間，設(shè)定為4種水平，分別是C1（1?h）、C2（3?h）、C3（16?h）、C4（24 h）。

1.2.5 ?離體萌發(fā)率統(tǒng)計和花粉管長度的測量 ?試驗設(shè)計為三因素多水平處理，4×5×4共80個組合。在顯微鏡下隨機觀察，以花粉管長度大于花粉直徑為花粉萌發(fā)標準[8]。每個組合重復(fù)3次，每次的觀察視野為3個。每個組合觀察視野的花粉?？倲?shù)為350～780粒，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率（花粉萌發(fā)率=萌發(fā)的花粉數(shù)/花粉?？倲?shù)×100%，結(jié)果取平均值）。同時，用顯微鏡微尺測量花粉管長度，每個組合觀察視野的花粉管數(shù)量為30～80個，計算其平均值。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理，用SAS 9.0軟件對組合進行差異顯著性、多元相關(guān)性及聚類分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?三因素對紅司花粉萌發(fā)率的影響

如表1所示，硼酸濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間對紅司花粉萌發(fā)率均有極顯著影響。空白對照CK的花粉萌發(fā)率僅為3.71%。從表2可見，60?mg/L硼酸濃度下花粉萌發(fā)率最高，為15.87%。12?℃低溫條件下花粉萌發(fā)率最高，為21.86%;花粉萌發(fā)率隨著培養(yǎng)溫度的升高而降低，44?℃高溫下會抑制花粉萌發(fā)。培養(yǎng)16?h，花粉萌發(fā)率達到最大值18.70%，顯著高于其他3個時間點;培養(yǎng)時間增加至24 h時，觀察視野中許多花粉管出現(xiàn)破裂，扭曲交纏，不利于統(tǒng)計萌發(fā)數(shù)量，導(dǎo)致萌發(fā)率在數(shù)據(jù)上出現(xiàn)下降。

從表3可見：60?mg/L硼酸+12?℃培養(yǎng)3 h、16 h，花粉萌發(fā)率達到48.59%、52.43%;兩因素的組合中，60 mg/L硼酸+12?℃（A3B1）的培養(yǎng)條件下，萌發(fā)率為38.43%，顯著高于其他水平組合;硼酸濃度與時間的最佳組合為60?mg/L硼酸+16?h（A3C3），萌發(fā)率為20.67%;培養(yǎng)溫度與時間的最佳組合為培養(yǎng)12?℃+16?h（B1C3），萌發(fā)率為31.43%。硼酸酸濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間三因素組合條件下花粉的萌發(fā)率大于雙因素組合。

2.2 ?三因素對紅司花粉管生長的影響

硼酸濃度和培養(yǎng)溫度及二者間的交互效應(yīng)對花粉管生長存在極顯著影響（表4）?？瞻讓φ誄K的紅司花粉管平均長度僅為44.40?μm。培養(yǎng)基中加入不同濃度的硼酸可促進花粉管生長，30?mg/L硼酸濃度為最佳處理水平，花粉管平均長度達到223.22?μm（表5、圖1）。低溫對花粉管的伸長有抑制作用，12?℃低溫培養(yǎng)下花粉管生長過慢，平均長度值僅為100.2?μm，20～36?℃為紅司花粉管生長適宜溫度區(qū)間（表5、圖2）;培養(yǎng)時間對花粉管生長的影響并不顯著（表4），培養(yǎng)時間3～16?h為花粉管快速生長階段，培養(yǎng)16?h時花粉管平均長度達到194.33 μm（表5）。

低濃度硼酸在高溫培養(yǎng)條件下對花粉管伸長有促進作用。30 mg/L硼酸在36?℃條件下分別培養(yǎng)3、16、24?h，花粉管平均長度分別達到了453.16、527.74、571.52?μm（表6），但培養(yǎng)24 h后400?μm以內(nèi)花粉管數(shù)量明顯減少（表7），不利于授粉成功率提高，因此，花粉管生長最佳處理水平為A2B4C3。

2.3 ?三因素的交互效應(yīng)對花粉管生長影響的聚類分析

采用類平均法將OB1～OB80共80個組合聚為3類，閾值為1.3193。如表7所示：第1類中，花粉管長度在400～1100?μm的花粉比例最高，平均數(shù)量為35.3個，200～400?μm的花粉平均數(shù)量為8.0個，200?μm以內(nèi)的花粉平均數(shù)量為6.3個;第2類中，200?μm以內(nèi)的花粉比例最高，平均數(shù)量為75.1個;其次為200～400?μm，花粉平均數(shù)量為11.7個，400～1100?μm的花粉僅為2.6個。第3類中，花粉管長度主要在200?μm，平均數(shù)量為30.45個，其次為200～400?μm的花粉，平均數(shù)量為5.7個，400～1100?μm的花粉平均數(shù)量為2.9個。說明30?mg/L硼酸在36?℃培養(yǎng)3～16?h后，對花粉管的伸長有明顯的促進作用。

2.4 ?三因素與紅司花粉萌發(fā)和花粉管生長的相關(guān)性

硼酸濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間多個變量對花粉萌發(fā)和花粉管生長影響的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)（表8）：花粉萌發(fā)率與培養(yǎng)溫度呈極顯著負相關(guān)（P<0.01），相關(guān)系數(shù)值為?0.6044;花粉萌發(fā)率、花粉管生長與硼酸濃度和培養(yǎng)時間均呈正相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)性均不顯著。兩組變量的典型相關(guān)性分析也得到了相同結(jié)果，證實多個變量因素中培養(yǎng)溫度（B）與花粉萌發(fā)率（y）極顯著相關(guān)，逐步回歸分析獲得二者的最優(yōu)方程y=31.06-0.58?B（R2=0.3773），方程極顯著（P<0.01）。說明溫度是影響紅司花粉萌發(fā)率最主要的因素，隨著溫度的增加，花粉萌發(fā)率表現(xiàn)為下降。此外，一定范圍內(nèi)硼酸濃度值對萌發(fā)和花粉管生長是有利的。

3 ?討論

影響花粉離體萌發(fā)率的因素除了培養(yǎng)基、溫度、硼酸濃度等因素外，還應(yīng)該考慮取材的一致性，應(yīng)盡量減少取材的次數(shù)，取回的多個花朵制成花粉混合懸浮液，讓每個處理都能在材料上保持基本一致。另外，較少的處理組合很難反應(yīng)花粉萌發(fā)及花粉管生長的真實狀況，應(yīng)盡量采用多因素多水平組合處理。0.5%瓊脂（Agar）+10%蔗糖（Sucrose）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，滴入花粉懸浮液后不培養(yǎng)直接觀察，可摸清楚花粉在培養(yǎng)前的萌發(fā)狀態(tài)。本試驗中，花粉在空白對照處理下花粉有3.71%極少量的萌發(fā)，花粉管平均長度僅為44.40?μm。

硼元素對花粉管生長具有調(diào)節(jié)作用，在構(gòu)建花粉細胞壁方面發(fā)揮作用，同時可能作為一種相關(guān)因子影響關(guān)鍵酶活性，改變細胞壁多糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以至細胞壁的延展性[9]。近年研究表明培養(yǎng)基中添加一定濃度硼酸有利于花粉萌發(fā)生長[10-12]。杜紀紅等[13]認為不同植物種類的花粉萌發(fā)和花粉管生長所需的最適硼酸濃度不同：如培養(yǎng)黃薇花粉適宜硼酸濃度為500～1000?mg/L[14];150?mg/L硼酸能顯著提高福鼎大白茶花粉萌發(fā)率[15];王玉林等[16]發(fā)現(xiàn)添加100?mg/L硼酸可使火龍果花粉離體萌發(fā)率顯著提高59.75%，而花粉管生長需要500?mg/L高濃度的硼酸;因此有必要對不同的植物開展研究。本研究結(jié)果表明，多肉植物紅司花粉萌發(fā)適宜的硼酸為60～100?mg/L，而花粉管的伸長僅需要30?mg/L低濃度的硼酸，隨著濃度的增加，花粉管生長受到抑制。

除了硼酸之外，溫度是影響萌發(fā)率及花粉管生長的重要因素，本實驗設(shè)置的處理溫度范圍為12～44?℃，從低溫區(qū)覆蓋至高溫區(qū)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示不同水平的溫度處理對花粉萌發(fā)和花粉管生長影響差異極顯著（P<0.01）。不同植物種類適宜花粉萌發(fā)的溫度有差異。地被菊的花粉適宜萌發(fā)溫度只有10～15?℃[17]，梅花等早春開花植物花粉萌發(fā)最佳溫度20?℃左右[18]，茉莉花粉最佳培養(yǎng)溫度為25～30?℃[19]，即使種內(nèi)不同品種的花粉適宜萌發(fā)溫度也有較大差異，實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，擬石蓮屬一些早開花品種如‘花月夜‘靈隱的花粉在15?℃低溫離體培養(yǎng)下花粉活力較高，平均萌發(fā)率分別達到66.67%、29.51%。而品種‘莎維娜的花粉在30?℃高溫培養(yǎng)下花粉萌發(fā)率達到26.67%。因此有必要針對重要的育種材料開展研究。紅司花粉萌發(fā)的適宜溫度范圍較廣，試驗表明12～28?℃溫度下花粉萌發(fā)率均較高，其中12?℃低溫條件下花粉萌發(fā)效果最佳（21.86%）;12?℃是本試驗設(shè)置的低溫，如果溫度更低，萌發(fā)率有可能更高，因此可以在實際育種工作中，嘗試更低溫度處理紅司花粉。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)溫度與萌發(fā)率呈負相關(guān)，與花粉管長度呈正相關(guān)，說明花粉萌發(fā)和花粉管生長可能需要不同的溫度條件。本試驗中，12～28?℃培養(yǎng)有利于提高花粉管萌發(fā)率，20～36?℃有利于花粉管的伸長，與蒿柳研究結(jié)果類似[20]。這對多肉植物育種可能有很好的指導(dǎo)作用，可以嘗試前期低溫誘導(dǎo)花粉大量萌發(fā)后，提高培養(yǎng)溫度促進花粉管伸長。

不同植物種類花粉管生長適宜觀察的培養(yǎng)時間存在差異。海仙花花粉培養(yǎng)6?h花粉管生長最快，狀態(tài)最好[21];礬根‘紅妝魅影培養(yǎng)時間達到2?h時，礬根花粉管發(fā)生明顯伸長[22];野杏花粉離體培養(yǎng)最佳時間為6?h[23]。本研究為了探明紅司花粉在24 h內(nèi)萌發(fā)及花粉管生長情況，同時基于試驗的可操作性。從早上9點取新鮮花粉處理后，放在不同處理下分別培養(yǎng)1、3、16、24 h，取出觀察拍片。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明：時間是影響紅司花粉萌發(fā)率的極顯著因素（P<0.01），對花粉管長度影響則不顯著（P>0.05）。空白對照中紅司花粉有3.71%少量萌發(fā)，平均花粉長度為44.40?μm。處理1?h后花粉的平均萌發(fā)率升高至10.43%，花粉管長度為130.42?μm。隨著培養(yǎng)時間的延長，3～16?h花粉萌發(fā)率迅速提高，花粉管生長加快。培養(yǎng)至16?h，平均萌發(fā)率（18.70%）與花粉管長度（194.33 μm）均達到最大值。培養(yǎng)時間的增加有利于花粉萌發(fā)率的上升及花粉管的伸長，但時間過長，部分已萌發(fā)的花粉出現(xiàn)花粉管破裂，扭曲交纏，不利于數(shù)據(jù)統(tǒng)計，這也是花粉在培養(yǎng)24?h之后萌發(fā)率在數(shù)據(jù)上出現(xiàn)下降原因之一。綜上所述，紅司花粉離體培養(yǎng)適宜的觀察時間可能在3～16?h之間，需要在實際育種工作中進一步縮小變量范圍，摸索最佳觀察時間。

方差分析顯示，硼酸濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間及交互效應(yīng)對花粉萌發(fā)率的影響差異極顯著，60?mg/L硼酸+12?℃+16?h培養(yǎng)下，萌發(fā)率達到最大值52.43%，極大的提高了花粉萌發(fā)率。硼酸濃度、培養(yǎng)溫度及交互效應(yīng)對花粉管伸長的影響極顯著。培養(yǎng)基中添加30?mg/L硼酸36?℃培養(yǎng)3～24?h后，400～1100?μm長度的花粉管比例最高，平均數(shù)量為35個，平均花粉管長度為3?h：453.16?μm、16?h：527.74?μm、24 h：571.52?μm，培養(yǎng)24 h雖然花粉管平均長度值最大，但400 μm以內(nèi)的花粉管數(shù)量僅為5個，不利于提高授粉成功率。綜合分析認為60?mg/L硼酸+12?℃+16?h （A3B1C3）為紅司花粉萌發(fā)較理想條件，30 mg/L硼酸+36?℃+16?h（A2B4C3）為紅司花粉管生長的適宜條件。

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