顯微穿刺糾正人三原核合子囊胚發(fā)育潛能的臨床研究

龍家敏 阮秋燕 唐秀法 朱露露 鐘慧芝 乃東紅 牛向麗

廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院(南寧，530021)

多原核是常規(guī)體外受精(IVF)治療的一種常見現(xiàn)象，其發(fā)生率可高達1%～30%[1-2]。三原合子(3PN)早期卵裂一般為3或多細胞,晚期發(fā)育停滯或形成非整倍體[3]。有報道稱3PN合子在發(fā)育過程可以完成自我糾正[4]，但移植這樣的胚胎最終會導致流產(chǎn)、葡萄胎或多倍體畸形兒的發(fā)生。如果可以通過顯微操作使3PN合子變?yōu)槎献?2PN)，將增加胚胎移植機會。因此，從多原核胚胎中去除多余雌/雄原核使其恢復(fù)為二倍體胚胎成為輔助生殖技術(shù)的一項研究熱點。1988年，Rawlins等[5]首次報道選擇性原核減滅技術(shù)( SPnR),利用顯微穿刺從人類多原核胚胎中去除多余雄原核使其恢復(fù)為二倍體。由于技術(shù)不夠完善，且在常規(guī)體外受精中，2PN合子比容易獲得，所以SPnR優(yōu)勢不大。隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，顯微操作設(shè)備和技術(shù)的不斷完善，去除多余原核后胚胎的存活率逐步提高。2003年新加坡科學家通過SPnR技術(shù)去除人3PN合子中多余的雄原核后，獲得健康新生兒[6]。2006年，Escriba等[7]報道應(yīng)用SPnR技術(shù)去除過多原核后，41%的胚胎可達到囊胚期，明顯高于未去原核的3PN組。實踐證實通過顯微操作技術(shù)糾正多原核合子，可為部分患者提供正常胚胎，增加了IVF治療中胚胎移植和妊娠的機會，對不孕癥的臨床治療具有重要意義。

1 對象和方法

1.1 研究對象

受精16～18 h在倒置顯微鏡下觀察并記錄在本院進行常規(guī)IVF 周期(非卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI))患者胚胎極體(PB)排出及原核形成情況，根據(jù)2PB+3(或以上)PN，判斷為多精受精合子。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，經(jīng)患者知情同意后，共收集44例不孕患者的多精受精3PN 151個，以及觀察記錄同期同一患者414個2PN合子發(fā)育情況。女方年齡(32.6±4.6)歲(23～44歲)，男方年齡(35.1±6.0)歲(22～56歲)。不孕因素中輸卵管因素占95.4%(42/44)、內(nèi)膜因素占11.9%(5/44)、排卵障礙22.7%(10/44)，本研究沒有納入男方不孕占主導因素的病例。

1.2 方法

1.2.1顯微操作的準備顯微操作在配備有37℃熱臺和NARISHIGE顯微操作系統(tǒng)的 ZEISS(1023619506，德國)倒置顯微鏡上進行。去核前1h預(yù)先準備操作皿，操作液為ICSI使用的PVP皿。3PN合子置于操作液后操作。

1.2.2原核的去除首先用外徑120μm，內(nèi)徑 25～30μm持卵針(Sunlight Medical,Inc. USA)固定3PN，在內(nèi)徑5.0μm穿刺針(Sunlight Medical,USA)的幫助下盡量將3PN固定在一個最佳位置，即將被吸出的原核清晰地顯示并最靠近穿刺針。根據(jù)雄原核一般比雌原核略大,雄原核所處位置離極體較遠而雌原核在兩個極體下端，第二極體比第一極體完整透明的形態(tài)學判斷標準[5-6，8]，吸取較大且遠離第二極體的原核。在200倍倒置顯微鏡下，穿刺針穿過透明帶，緩慢進入卵胞漿內(nèi)，置于將要吸取的原核上方切面上，抽吸原核, 最好將核膜完整吸出，如果核膜破裂，將核漿及核仁完全吸出，勿傷及其他原核。操作完成后將3→2PN移入(ART-1026)培養(yǎng)液(Cooper Surgical，USA)微滴中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，此操作與2PN組正常2PN培養(yǎng)方法一致。在48h后觀察發(fā)育情況并記錄胚胎質(zhì)量。

1.2.3胚胎發(fā)育情況顯微操作去核當日為第1天，第3天將培養(yǎng)液更換為(ART-1029)培養(yǎng)液,(Cooper Surgical, USA)。于第5，6天觀察其發(fā)育情況，記錄囊胚形成情況，如果第6天形成1期囊胚，可觀察至第7天。達到≥3BC評級的囊胚行玻璃化冷凍保存(VT101, Kitazato Corporation, Japan)。2PN組只觀察到第6天。

1.2.4胚胎質(zhì)量評估標準優(yōu)質(zhì)胚胎：D3 1～2級、≥6細胞的胚胎和提前進入融合期的胚胎?？捎媚遗撸耗遗咴u級≥3BC。

1.2.5解凍、取樣及基因分析解凍：于送檢當天解凍，解凍程序按照玻璃化凍存胚胎解凍程序進行(VT102, Kitazato Corporation, Japan)。解凍完成后置于ART-1029培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2h。對同一囊胚分別進行囊胚滋養(yǎng)細胞層(TE)和內(nèi)細胞團細胞(ICM)取樣，按照PGD取樣方法進行[9]。取樣完成置于有細胞裂解液的PCR管中，-20℃保存。新一代基因測序技術(shù)(NGS)、染色體拷貝數(shù)變異(CNV)分析，由江蘇億康基因科技有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計學分析。進行χ2檢驗。P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

顯微操作去原核的3PN共有151個，去原核成功共141個(3→2PN組)，顯微穿剌抽取原核的成功率為93.4%。同期同一患者的兩原核受精卵共414個(2PN組)。

2.2 胚胎發(fā)育情況

3→2PN組D3退化率、胚胎卵裂率和D5～D7囊胚形成率低于2PN組，≥6細胞胚胎形成率、優(yōu)質(zhì)胚胎形成率高于2PN組(均P<0.001)。3→2PN組與2PN組可用囊胚率相似(P=0.163) 。3→2PN組共凍存8枚可用囊胚(表1)。

表1 3→2PN組與2PN組胚胎發(fā)育指標比較(%)

2.3SPnR后形成的囊胚基因檢測

解凍8枚凍存囊胚，復(fù)蘇成活6枚，復(fù)蘇率為75.0%?？偣矙z測了來自5位不孕患者的6個囊胚，其中包括6份TE樣本和5份ICM樣本，總共11份樣本。 NGS及CNV分析結(jié)果顯示，其中10份樣本核型檢查結(jié)果為46，XN；1份TE樣本檢查結(jié)果為46,XN,-6p(×1,mos,～40%),-6q(×1,mos,～50%)，同一囊胚的ICM為46,XN(表2)。以TE樣本計算整倍體率為83.3%(5/6)，以ICM樣本計算整倍體率為100%(5/5)。

表2 3→2PN胚胎形成囊胚的非整倍體分析

3 討論

3.1 多原核的形成機制

在常規(guī)IVF中，多原核合子的形成原因包括精子原因的多精子受精[10],其主要是多精入卵阻止機制不完善引起，與卵子的不成熟、卵子過熟、精子濃度、血清中高雌激素水平、皮質(zhì)反應(yīng)、透明帶的異常等有關(guān)。卵子的第一、第二極體不釋放導致2倍體或多倍體卵子[11-12], 或含多倍體的單精子及單倍體的卵子受精，其中多精子受精是最主要的原因。

3.2 顯微操作對多3→2PN退化率的影響

在本研究中, 經(jīng)顯微穿刺抽吸后3→2PN第48h退化率達到了21.3%。3→2PN退化的原因是多方面的：可能是穿刺損傷了合子的胞膜,引起胞漿物質(zhì)的外溢，穿刺結(jié)束后就退化；穿刺針進入胞質(zhì)及抽吸力可能影響合子的細胞骨架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,導致細胞不能分裂甚至退化。

3.3 顯微操作對多3→2PN卵裂率的影響

本研究結(jié)果顯示, 經(jīng)顯微穿刺抽吸后3→2PN第48h的多原核合子的分裂率, 低于正常2PN的卵裂率,與之前文獻報道的研究結(jié)果不一致[13-14]。不卵裂的可能原因：去核不完全或保留的2個原核可能受到損傷，導致染色體數(shù)目變異，或者雌原核的核仁受到部分破壞，而母源的核仁是胚胎基因激活的必需，從而導致細胞卵裂阻滯[15]；由于判斷錯誤吸去雌原核,保留了2個雄原核，而早期卵裂所需要的物質(zhì)和調(diào)控因子主要來源于母源因子，在胚胎基因激活的過程中，母源因子同樣發(fā)揮了很重要的作用，例如Brg 1對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控是胚胎基因激活的關(guān)鍵,還有Npm2、Ago2、Atg5、Ring1、Rnf2及Sox2等基因的敲除和敲低都會導致胚胎基因激活異常及卵裂期胚胎發(fā)育阻滯[16-22]。

3.4 顯微操作對多3→2PN囊胚形成率的影響

3→2PN組囊胚形成率低于2PN組，與之前文獻報道的研究結(jié)果一致[13-14]。可能是由于胚胎卵裂模式異常，導致胚胎發(fā)育阻滯。有研究發(fā)現(xiàn)，精子來源的中心體及中心粒決定著人類胚胎的紡錘體形成，控制著受精后的的第 1 次有絲分裂，而卵子的中心粒可能不起作用[23]。如果合子中一個以上具有功能的中心體會導致多級紡錘體。有研究對合子第一次分裂時紡錘體的染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多精受精的合子紡錘體形成異常，去除多余原核后有部分合子可形成正常形態(tài)的紡錘體，但是仍有一部分合子的紡錘體異常，其原因可能是因為去除多余的雄原核時未能將多余的父源中心體同時去除，而導致多級紡錘體[14，24]。因此，在去核操作時應(yīng)同時吸取原核周圍的少量胞漿，以期能夠去除多余的中心體，使合子能夠形成正常的雙極紡錘體。但觀察第3天胚胎發(fā)育情況, 3→2PN組≥6細胞胚胎形成率及優(yōu)質(zhì)胚胎率均高于2PN組，但可用囊胚率兩組沒有差異，說明穿刺成功的合子能夠正常發(fā)育且可形成囊胚。

3.53→2PN形成可用囊胚核型分析

3→2PN形成可用囊胚冷凍后解凍復(fù)蘇率為75.0%(6/8),本院同期囊胚解凍復(fù)蘇率約為97.0%。3→2PN組形成的可用囊胚經(jīng)NGS及CNV分析，除一個TE樣本核型分析顯示異常外(46,XN,-6p(×1,mos,～40%),-6q(×1,mos,～50%)，其余10個樣本核型分析均為正常(46，XN)，且與同一個顯示異常的TE樣本同一來源的ICM標本顯示為正常，所以3→2PN組形成的可用囊胚可利用率具有一定的臨床意義。

由于對雌雄原核的鑒別并非絕對可靠, 所以并不能肯定移出的原核就是多余的。鑒于此, 對于糾正后的胚胎利用需要結(jié)合胚胎植入前遺傳學診斷, 確定其染色體組為正常的二倍體 。