沉默ERK5對乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞MCF-7/ADM耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制*

張瀚文， 張江濤， 龐 森， 陳 俊， 徐鈺駒， 吳向華△

1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科，南寧 530021 2山東菏澤市立醫(yī)院胃腸外科，菏澤 274000 3廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，廣州 511400 4廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院移植科，南寧 530021

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，術(shù)后化療及新輔助化療是治療乳腺癌的重要手段[1]。但乳腺腫瘤耐藥現(xiàn)象在臨床治療中有著相當(dāng)高的比例，易導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后[2]。因此，尋找調(diào)控乳腺癌耐藥性靶基因具有重要意義。

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(extracellular signal regulated kinase 5，ERK5)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路家族成員之一[3]。近年來，相關(guān)研究表明ERK5在惡性腫瘤中表達(dá)活躍且與腫瘤的生長侵襲有關(guān)[4]。其中，Clape等[5]研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中ERK5可作為microRNA-143的靶基因介導(dǎo)腫瘤發(fā)生。Montero等[6]研究發(fā)現(xiàn)，ERK5在早期乳腺癌的發(fā)展過程中處于高表達(dá)水平，并可作為獨立預(yù)后指標(biāo)。此外，Miranda等[7]研究認(rèn)為MEK5/ERK5通路過表達(dá)與乳腺癌全身化療患者存活率差相關(guān)。我們先前的研究也顯示：復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中ERK/MAPK通路明顯激活[8]。上述研究提示ERK5可能參與乳腺癌化療耐藥，但目前鮮有ERK5與乳腺癌耐藥相關(guān)性的研究報道。本研究首先檢測乳腺癌耐藥細(xì)胞與正常乳腺細(xì)胞及乳腺癌非耐藥細(xì)胞中ERK5表達(dá)水平差異，后應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默ERK5在乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM中的表達(dá)，重點探討ERK5對乳腺癌耐藥性的影響及其潛在機(jī)制。我們期望提供關(guān)于ERK5調(diào)控乳腺癌耐藥性作用的新見解。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑

人乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/ADM、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及人正常乳腺細(xì)胞株Hs578Bst購自中科院上海生化細(xì)胞所；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購自Gibco公司；嘌呤霉素購自Sigma公司；阿霉素購自上海源葉公司；qRT-PCR相關(guān)試劑購自TaKaRa公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；Annexin Ⅴ-APC凋亡試劑盒及細(xì)胞周期試劑盒購自聯(lián)科生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 shRNA的合成及慢病毒載體的構(gòu)建 靶向沉默ERK5基因序列5′-GCTGCCCTGCTCAA-GTCTTTG-3′的短發(fā)夾RNA(ERK5-shRNA)的合成、測序與慢病毒載體構(gòu)建均委托上海吉凱基因公司完成。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MCF-7/ADM及正常乳腺細(xì)胞Hs578Bst接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，并置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MCF-7/ADM細(xì)胞培養(yǎng)液中額外加入終濃度為1 μg/mL的阿霉素以維持其耐藥性，實驗前1周改用無阿霉素培養(yǎng)液。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)供應(yīng)商提供的說明書將MCF-7/ADM細(xì)胞分為兩組接種于6孔板中。ERK5沉默組(shERK5組)：使用攜帶ERK5-shRNA的慢病毒感染細(xì)胞用以沉默細(xì)胞中ERK5的表達(dá)；陰性對照組(shCtrl組)：使用攜帶陰性對照shRNA的慢病毒感染細(xì)胞作為對照。連續(xù)培養(yǎng)72 h后以嘌呤霉素篩選細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡觀察慢病毒感染率，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測ERK5沉默效率。

1.2.4 qRT-PCR檢測ERK5 mRNA相對表達(dá)水平 Trizol法從細(xì)胞中提取總RNA。NanoDrop分光光度計測定樣品總RNA的濃度，并使用oligo(dT)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒在ABI 7500 PCR儀中對得到的cDNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海吉凱基因公司合成，GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。2-ΔΔCt法分析qRT-PCR實驗原始數(shù)據(jù)，計算各組細(xì)胞ERK5 mRNA相對表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.2.5 CCK-8法檢測沉默ERK5對MCF-7/ADM細(xì)胞耐藥性的影響 胰酶消化，收集轉(zhuǎn)染后MCF-7/ADM細(xì)胞，以5000個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h至細(xì)胞貼壁。實驗細(xì)胞分為兩組：shERK5組與shCtrl組，并換用含不同濃度阿霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)。阿霉素終濃度為：0、5、10、20、40 μg/mL，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h并使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處吸光度值(A450nm)。計算各藥物濃度下細(xì)胞抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.6 克隆形成實驗檢測沉默ERK5對MCF-7/ADM細(xì)胞增殖的影響 胰酶消化，收集轉(zhuǎn)染后MCF-7/ADM細(xì)胞，以1000個/孔均勻接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h至細(xì)胞貼壁。實驗細(xì)胞分為4組：shERK5+阿霉素干預(yù)組(15 μg/mL)、shCtrl+阿霉素干預(yù)組(15 μg/mL)、shERK5+無阿霉素組、shCtrl+無阿霉素組，每組設(shè)3個復(fù)孔。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)10 d后，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色30 min。將處理后的細(xì)胞培養(yǎng)板風(fēng)干、拍照并進(jìn)行克隆計數(shù)。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測沉默ERK5對MCF-7/ADM細(xì)胞凋亡及周期的影響 胰酶消化，收集轉(zhuǎn)染后的MCF-7/ADM細(xì)胞，以5×105個/孔接種于6孔板中。實驗細(xì)胞分為4組：shERK5+阿霉素干預(yù)組(15 μg/mL)、shCtrl+阿霉素干預(yù)組(15 μg/mL)、shERK5+無阿霉素組、shCtrl+無阿霉素組，每組3個復(fù)孔。細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)72 h后，用胰酶消化并收集細(xì)胞于離心管中。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，離心5 min，重復(fù)2次。分別進(jìn)行①細(xì)胞凋亡測定：向每管細(xì)胞加入5 μL Annexin Ⅴ-APC試劑混勻，室溫下避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況；②細(xì)胞周期測定：向每管細(xì)胞加入預(yù)冷無水乙醇，4℃下固定過夜，次日離心棄上清液，PBS水化細(xì)胞，最后向每管細(xì)胞中加入100 μL RNA酶(RNase A，100 μg/mL)和1 mL碘化丙啶(PI，50 μg/mL)溶液混勻，常溫下避光孵育1 h，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA))，并使用最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERK5 mRNA在MCF-7/ADM細(xì)胞中呈顯著高表達(dá)

qRT-PCR檢測各細(xì)胞株中ERK5 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與正常乳腺組織細(xì)胞Hs578Bst(0.62±0.10)和乳腺癌非耐藥細(xì)胞MCF-7(0.54±0.08)相比，乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞MCF-7/ADM中ERK5 mRNA呈顯著高表達(dá)[(1.00±0.10)，均P<0.05]。這表明ERK5基因可能參與調(diào)控MCF-7/ADM細(xì)胞耐藥。

2.2 ERK5-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染沉默MCF-7/ADM細(xì)胞ERK5的表達(dá)

MCF-7/ADM細(xì)胞經(jīng)攜帶ERK5-shRNA或陰性對照shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染后，熒光倒置顯微鏡觀察慢病毒感染率：兩組細(xì)胞慢病毒感染率即綠色熒光蛋白表達(dá)率大于80%(圖1)。qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示，與shCtrl組(1.00±0.06)相比，shERK5組細(xì)胞中ERK5 mRNA的表達(dá)(0.34±0.06)被顯著敲低(P<0.05)，沉默效率為65.9%。表明ERK5-shRNA能夠有效沉默MCF-7/ADM細(xì)胞中ERK5的表達(dá)，兩組細(xì)胞可以作為后續(xù)實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

圖1 ERK5-shRNA及陰性對照shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光表達(dá)圖像(×200)Fig.1 The fluorescence expression images of ERK5-shRNA and negative control shRNA lentivirus transfected cells(×200)

2.3 沉默ERK5增強(qiáng)了MCF-7/ADM細(xì)胞對阿霉素的藥物敏感性

CCK-8法檢測shCtrl組與shERK5組細(xì)胞對阿霉素的藥物敏感性。shERK5組IC50為(15.75±1.01)μg/mL，低于shCtrl組的(27.24±1.85)μg/mL(P<0.05)。同樣，與shCtrl組細(xì)胞相比，shERK5組細(xì)胞在不同濃度阿霉素作用下的72 h細(xì)胞抑制率顯著增高(均P<0.05，表2)。這些結(jié)果表明沉默ERK5可增強(qiáng)乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM對阿霉素的敏感性。

表2 不同濃度阿霉素作用后72 h細(xì)胞生長抑制率Table 2 Cell growth inhibition rate after treatment with adriamycin of different concentrations for 72

2.4 沉默ERK5抑制阿霉素作用下MCF-7/ADM細(xì)胞的增殖能力

克隆形成實驗結(jié)果顯示：無阿霉素或15 μg/mL阿霉素干預(yù)下，shERK5組MCF-7/ADM細(xì)胞克隆形成能力均顯著低于shCtrl組細(xì)胞(均P<0.05)，見表3。且在阿霉素干預(yù)下這種增殖能力差異更明顯。這些數(shù)據(jù)表明沉默ERK5顯著抑制了MCF-7/ADM細(xì)胞的增殖能力。

表3 各組MCF-7/ADM細(xì)胞克隆數(shù)及凋亡率Table 3 Colony-forming units number and apoptosis rate of MCF-7/ADM cells in each

2.5 沉默ERK5促進(jìn)MCF-7/ADM細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：阿霉素干預(yù)前后，shERK5組細(xì)胞凋亡率均大于shCtrl組細(xì)胞凋亡率(均P<0.05)，見圖2、表3。這些數(shù)據(jù)表明沉默ERK5促進(jìn)MCF-7/ADM細(xì)胞凋亡。

圖2 無阿霉素和15 μg/mL阿霉素干預(yù)下MCF-7/ADM細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of MCF-7/ADM cells without adriamycin and with 15 μg/mL adriamycin

2.6 沉默ERK5調(diào)控MCF-7/ADM細(xì)胞的周期分布

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布結(jié)果顯示：有無阿霉素干預(yù)shERK5組處于G0/G1期細(xì)胞比例均大于shCrtl組(均P<0.05；圖3、表4)。無阿霉素作用下，兩組處于S期細(xì)胞比例無明顯差異(P> 0.05)，G2/M期細(xì)胞比例shERK5組小于shCtrl組(P<0.05)；15 μg/mL阿霉素干預(yù)下，兩組處于S期、G2/M期細(xì)胞比例均無明顯差異(均P> 0.05)。這些數(shù)據(jù)說明沉默ERK5影響MCF-7/ADM細(xì)胞周期分布，可能與調(diào)控G0/G1期細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。

A：shCtrl；B：shERK5圖3 無阿霉素和15 μg/mL阿霉素干預(yù)下MCF-7/ADM細(xì)胞周期分布情況Fig.3 Cell cycle distribution of MCF-7/ADM without adriamycin and with 15 μg/mL adriamycin

表4 各組MCF-7/ADM細(xì)胞周期分布比例Table 4 Proportion of cell cycle distribution of MCF-7/ADM in each

3 討論

乳腺癌患者化療成功最主要的障礙是腫瘤耐藥性的產(chǎn)生[9]。靶向分子治療作為乳腺癌治療研究的新熱點，為解決乳腺腫瘤耐藥提供了新的思路[10]。ERK5在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及周期進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。Akao等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ERK5蛋白水平的降低可促進(jìn)白血病細(xì)胞的凋亡。Ye等[12]研究發(fā)現(xiàn)阻斷ERK5通路會抑制細(xì)胞周期蛋白D1、周期蛋白E和CDK4的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯于G1期。目前關(guān)于ERK5與乳腺癌的研究較少，多數(shù)研究認(rèn)為ERK5在乳腺癌中高表達(dá)并與乳腺癌的生長侵襲相關(guān)[13-14]，也有研究認(rèn)為ERK5在乳腺癌中表達(dá)水平較低，可能負(fù)性調(diào)節(jié)乳腺癌的生長增殖[15]。而我們目前的研究認(rèn)為，ERK5在乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM中表達(dá)水平較高，并與乳腺癌耐藥性的形成相關(guān)。

ERK5作為MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路家族最晚被發(fā)現(xiàn)的成員，其結(jié)構(gòu)功能與其他家族成員有著諸多相似之處[3]。MAPK通路家族其他3個成員ERK1/2、p38、JUN參與調(diào)控腫瘤的耐藥性已被相關(guān)研究所證實[16-18]。這些研究提示ERK5也可能參與腫瘤耐藥性的調(diào)控。

基于對目的基因高度特異性的抑制作用，RNA干擾技術(shù)被廣泛應(yīng)用于腫瘤基因治療、靶向藥物的研發(fā)及腫瘤機(jī)制研究中[19]。本研究采用ERK5-shRNA有效沉默了MCF-7/ADM細(xì)胞中ERK5 mRNA表達(dá)，進(jìn)而觀察沉默ERK5對MCF-7/ADM細(xì)胞的增殖、凋亡、周期進(jìn)程及藥物敏感性的影響，以探討其相關(guān)機(jī)制。本次研究發(fā)現(xiàn)，相較于非耐藥細(xì)胞MCF-7與正常乳腺細(xì)胞Hs578Bst，ERK5在乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM中呈較高的表達(dá)水平。CCK-8與克隆形成實驗結(jié)果提示沉默ERK5可增強(qiáng)MCF-7/ADM細(xì)胞對阿霉素藥物的敏感性，并有效抑制阿霉素干預(yù)前后MCF-7/ADM細(xì)胞的克隆形成能力。這表明ERK5可調(diào)控MCF-7/ADM細(xì)胞的生長增殖及耐藥性。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，沉默ERK5可促進(jìn)阿霉素干預(yù)前后MCF-7/ADM細(xì)胞的凋亡，并一定程度使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，從而抑制癌細(xì)胞的生長。因此，我們認(rèn)為在乳腺癌中ERK5可能作為一個癌基因，通過減少細(xì)胞凋亡和加速細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)揮促癌作用，并參與乳腺癌耐藥性的調(diào)控。目前我們僅驗證了ERK5在乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株的作用，ERK5在其他乳腺癌耐藥株中的作用需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，ERK5是調(diào)控乳腺癌進(jìn)展的重要基因。我們的研究提示，ERK5在乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM中高表達(dá)，沉默ERK5可逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADM細(xì)胞的阿霉素耐藥性。未來靶向干擾ERK5可能成為干預(yù)乳腺腫瘤化療耐藥的新策略。