紫蘇褐斑病菌的分離鑒定及抑菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定

趙劉趙，商志偉，楊小華，羅 充*

(1.貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 油菜研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；3.貴州省銅仁市碧江區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 銅仁 554300)

【研究意義】褐斑病是造成作物大量減產(chǎn)的常見病害之一，其具有發(fā)病快，傳染力強(qiáng)等特點(diǎn)。一旦有植株感染可快速傳播，使大批植株感染，導(dǎo)致葉片枯死、脫落，嚴(yán)重減產(chǎn)。【前人研究進(jìn)展】植物的褐斑病多由鏈格孢屬真菌(AlternariaNees)引起[1-5]，且往往使受感染的植物產(chǎn)生相應(yīng)癥狀。獼猴桃褐斑病的典型癥狀為葉片上具有明顯輪紋的褐色壞死斑，病斑直徑為1～2.5 cm[6]；柑橘感染褐斑病后出現(xiàn)莖干底部腐爛、幼苗死亡、流膠等癥狀[1]。鏈格孢屬真菌的分生孢子營(yíng)腐生或寄生，其代謝產(chǎn)物含毒素，可使農(nóng)作物產(chǎn)生黑斑病或褐斑病等病癥，進(jìn)而產(chǎn)生葉斑和組織腐爛等[6]。鏈格孢屬真菌不僅對(duì)植物產(chǎn)生危害，其還能產(chǎn)生70多種有毒代謝物，攝入被鏈格孢毒素感染的食品可使人、畜產(chǎn)生中毒現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)還可能致畸和致癌等[7]。甲霜錳鋅、烯酰錳鋅和代森錳鋅對(duì)防治植物真菌有明顯效果，其中，代森錳鋅常被用于防治植物的褐斑病[6，8-9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于紫蘇的研究多集中在紫蘇成分的分離純化或基因?qū)用鎇10-15]，鮮見關(guān)于紫蘇褐斑病的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒于此，采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合對(duì)從紫蘇褐斑病病葉分離到的菌株進(jìn)行鑒定，在此基礎(chǔ)上采用抑菌圈法室內(nèi)測(cè)定3種常見抑菌劑對(duì)紫蘇褐斑病的防治效果，以期為規(guī)模化生產(chǎn)紫蘇褐斑病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 病原 感染紫蘇(PerillafrutescensL.Britt.)葉片，采自貴州師范大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，葉片即采即用。

1.1.2 試劑 DP336試劑盒，成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 藥劑 72 %甲霜錳鋅(主要成分為8 %甲霜靈、64 %代森錳鋅)，允發(fā)化工(上海)有限公司；69 %烯酰錳鋅(主要成分為9 %烯酰嗎啉、60 %代森錳鋅)，江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司；70 %代森錳鋅可濕性粉劑，陜西道森農(nóng)業(yè)生態(tài)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌株的分離純化與鑒定 ①材料預(yù)處理。選取新鮮染病的紫蘇葉片，將其置于流動(dòng)自來(lái)水下沖洗30 min，然后浸泡于75 %酒精中在超凈工作臺(tái)上消毒6 s左右，取出用無(wú)菌水將其表面多余的酒精沖洗干凈后，使用2 %升汞溶液消毒2 min，再用無(wú)菌水沖洗葉片表面殘余藥品溶液，之后使用高壓滅菌處理的干燥濾紙擦干葉片備用。②分離純化。用消毒的解剖針在葉片有斑塊的地方輕刮幾下，將刮下的病菌孢子用劃線法接種至PDA培養(yǎng)基上，然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～3 d。挑選分離培養(yǎng)基中數(shù)量和面積均占主導(dǎo)地位的菌落，用消毒解剖針刮下其孢子，在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行接種。將接種的培養(yǎng)基置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～3 d；反復(fù)接種培養(yǎng)直至培養(yǎng)基上只有單一菌落即完成純化工作。③鑒定。以純化的培養(yǎng)基制備孢子懸浮液，用DP336試劑盒提取菌種DNA，并以此DNA為模板，以通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR檢測(cè)病原菌株反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，30個(gè)循環(huán)(98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s)，72 ℃終延伸，保存于4 ℃。擴(kuò)增后的片段溶于無(wú)菌去離子水中，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。? % Tsingke高純度低電滲瓊脂糖電泳，在150 V、100 mA的環(huán)境下電泳20 min；然后用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)所需DNA目的條帶進(jìn)行切割，直接對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行引物測(cè)序。

1.2.2 抑菌劑的篩選 將70 %代森錳鋅、72 %甲霜錳鋅和69 %烯酰錳鋅按照使用說(shuō)明稀釋成500、600、700和800倍液。將事先純化好的培養(yǎng)基中的真菌孢子制備成1×106個(gè)/mL孢子懸浮液，在PDA平板培養(yǎng)基上接種0.1 mL的孢子懸浮液，于25 ℃黑暗恒溫培養(yǎng)24 h。將直徑6 mm的無(wú)菌濾紙片在藥品稀釋液中浸沒10 min，取出放在均勻涂抹菌液且已培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)基中均勻放置4片濾紙(分別經(jīng)同一藥品不同濃度的藥液浸泡)，對(duì)照組放置浸泡清水的濾紙片。共計(jì)13個(gè)處理，3次重復(fù)。于25 ℃黑暗恒溫培養(yǎng)5 d后，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑并記錄，計(jì)算抑菌率。根據(jù)濃度(x)和抑菌率(y)擬合3種藥劑的毒力回歸方程，并計(jì)算EC50。

抑菌率=(處理直徑-對(duì)照直徑)/處理直徑×100 %

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010和Spss 25對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué) 從圖1可見，病原菌菌落為圓形或近圓形，中間為深褐色，邊緣為灰白色，隨著菌落的擴(kuò)大，褐色面積逐漸增大，最終變?yōu)楹谏?，有豐富氣生菌絲，表面為絨毛狀；分生孢子梗多為單生或簇生，形狀多為長(zhǎng)卵圓形、棒形或梨形，有多個(gè)橫隔膜，分隔處有縊縮。結(jié)合菌落形態(tài)、分生孢子類型等參照《中國(guó)真菌志》[16]，初步判斷該菌株為鏈格孢屬真菌(Alternariasp.)。

2.1.2 分子生物學(xué) 從圖2～3看出，利用ITS4/ITS4真菌通用引物對(duì)試劑盒提取到的病原菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增片段大小為700 bp左右。將樣本ITS測(cè)序結(jié)果在NCBI庫(kù)中與登記的物種進(jìn)行同源性檢索比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與Altemariaaltemata(序列號(hào)MG755752.1)的同源率達(dá)100 %，再結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定該菌株為鏈格孢屬真菌(Alternariaalternata)。

2.2 不同藥劑的抑菌效果

從圖4和表1看出，PDA培養(yǎng)基上紙片周圍出現(xiàn)明顯的抑菌圈，不同藥品及其不同濃度所產(chǎn)生的抑菌圈大小不同。

2.2.1 抑菌率 不同藥劑的抑菌率均與稀釋倍數(shù)成反比，即隨著稀釋倍數(shù)增加，各藥劑抑菌率呈下降趨勢(shì)。500～800倍，72 %甲霜錳鋅、69 %烯酰錳鋅和70 %代森錳鋅的抑菌率分別為61.9 %～73.4 %、66.3 %～69.7 %和64.3 %～67.7 %，以稀釋500倍時(shí)3種藥劑的抑菌率均最大。72 %甲霜錳鋅的抑菌率波動(dòng)較大，最大值與最小值相差11.5 %，二者存在顯著差異；其次是69 %烯酰錳鋅，相差4.8 %；70 %代森錳鋅相差最小，相差3.4 %。在最大稀釋倍數(shù)(800倍)時(shí)，70 %代森錳鋅的抑菌效果最佳，為66.3 %；72 %甲霜錳鋅的抑菌效果相對(duì)較差，為61.9 %。70 %代森錳鋅和69 %烯酰錳鋅各濃度的抑菌率無(wú)顯著差異，72 %甲霜錳鋅800倍液的抑菌率與該藥劑其余濃度間差異顯著。經(jīng)擬合濃度(x)與抑制率(y)得到3種藥劑的毒力回歸方程：y代森錳鋅=6.92+0.52x(R=0.952*)，y甲霜錳鋅=9.78+1.52x(R=0.970*)和y烯酰錳鋅=6.61+0.43x(R=0.956*)，其相關(guān)系數(shù)均接近1，說(shuō)明，據(jù)此得出的EC50可信度較高。其中，69 %烯酰錳鋅EC50為0.16 μg/mL，菌絲整體抑制效果最好；70 %代森錳鋅的抑制效果其次，其EC50為0.19 μg/mL；72 %的甲霜錳鋅EC50為0.76 μg/mL，對(duì)菌絲的抑制未產(chǎn)生明顯效果。

2.2.2 抑菌圈直徑 不同藥劑隨著藥品稀釋倍數(shù)增加其平均抑菌圈直徑均逐漸減小。500～800倍，72 %甲霜錳鋅、69 %烯酰錳鋅和70 %代森錳鋅的抑菌圈直徑分別為15.76～22.53、16.81～18.56和17.79～19.79 mm，3種藥劑的抑菌圈直徑均在最低稀釋倍液(500倍)時(shí)達(dá)最大。70 %代森錳鋅和69 %烯酰錳鋅各濃度間抑菌圈直徑無(wú)顯著差異，72 %甲霜錳鋅800倍液的抑菌圈直徑與該藥劑其余濃度間差異顯著(圖4，表1)。

表1 不同藥劑各濃度處理病原菌的抑菌率與抑菌圈直徑

3 討 論

鏈格孢屬真菌是世界上分布最廣的真菌之一，可侵害多種植物，在作物間極易傳播，造成不同作物相互感染，致使作物大量減產(chǎn)。因此，挑選容易購(gòu)買，經(jīng)濟(jì)有效的抑菌劑十分重要。72 %甲霜錳鋅、70 %代森錳鋅和69 %烯酰錳鋅均屬于低毒高效的廣譜性抑菌劑。研究結(jié)果表明，除在最高和最低濃度時(shí)藥品抑菌率差異性顯著外，3種藥劑中間濃度的抑菌率差異不顯著，可能因3種藥品的有效成分均含有代森錳鋅所致。3種藥劑在高濃度時(shí)對(duì)鏈格孢屬真菌有較好的抑制效果，與馮連榮等[9]的結(jié)果一致，但考慮到對(duì)植株本身的傷害和污染問題，選用較低濃度即有明顯效果的抑菌劑最好。69 %烯酰錳鋅EC50最低，為0.16μg/mL，對(duì)菌絲生長(zhǎng)的整體抑制效果最好，可作為紫蘇褐斑病防治的首選藥物之一。同時(shí)，72 %甲霜錳鋅的抑菌率大小差值較大，說(shuō)明隨著濃度減小，其抑菌效果將大幅下降，因此使用時(shí)應(yīng)選擇適宜存濃度。70 %代森錳鋅也具有較好的抑制效果，500倍稀釋液的抑菌率將近70 %，與劉娟等[1，9]的結(jié)果相似。

紫蘇整個(gè)生長(zhǎng)期均有可能感染褐斑病，災(zāi)害嚴(yán)重時(shí)可造成植株大片死亡，最終導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)。除在紫蘇感染時(shí)使用抑菌劑進(jìn)行補(bǔ)救外，提高田間管理質(zhì)量也十分重要。當(dāng)植株開始出現(xiàn)枯斑時(shí)，應(yīng)在早晨去掉葉面的水；當(dāng)周圍其他植物出現(xiàn)褐斑病病害時(shí)，應(yīng)及時(shí)隔離或噴灑農(nóng)藥，防止大規(guī)模傳染。

該研究對(duì)紫蘇褐斑病的病原菌只鑒定到屬，藥劑篩選只能反映出3種藥劑的室內(nèi)效果。田間的實(shí)際施用效果及藥劑交替噴施效果等問題還有待更深入的研究。同時(shí)，有研究表明[17]，在其他真菌病害的防治方面，植物提取液也有一定效果。因此，研究植物提取液對(duì)紫蘇褐斑病的防治效果同樣具有重要意義。

4 結(jié) 論

該研究確定紫蘇褐斑病的病原菌株為鏈格孢屬真菌(AlternariaNees)；3種常規(guī)廣譜抑菌劑72 %甲霜錳鋅、70 %代森錳鋅和69 %烯酰錳鋅的500～800倍液均對(duì)紫蘇褐斑病有一定的防治效果，其中，69 %烯酰錳鋅對(duì)菌絲生長(zhǎng)的整體抑制效果最好，其EC50為0.16 μg/mL。