Kisspeptin10對(duì)初情期前雌性小鼠生殖的影響及作用機(jī)制

梅 山，楊 麗，史遠(yuǎn)剛，淡新剛*

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，寧夏 銀川 750004)

【研究意義】灘羊是寧夏及毗鄰地區(qū)獨(dú)特的綿羊種質(zhì)資源，其肉質(zhì)和皮毛知名度較高。然而灘羊最大的問題在于繁殖力低下，這不僅因?yàn)樗菃翁?dòng)物，更重要的是，它是典型的季節(jié)性繁殖動(dòng)物。因此，在乏情季節(jié)促進(jìn)灘羊發(fā)情、排卵是提高其繁殖力重要手段。【前人研究進(jìn)展】Kisspeptin(KP)，一種kiss1基因的產(chǎn)物，它是調(diào)控GnRH釋放的主要因子。Kiss1基因編碼145個(gè)氨基酸，在體內(nèi)進(jìn)一步被加工、剪切成各種不同長(zhǎng)度的有生物活性的多肽(命名為kisspeptin54，kisspeptin14，kisspeptin 13，kisspeptin10)，所有這些肽在其C末端都擁有10個(gè)氨基酸的基序，并且在不同種屬間顯示出相當(dāng)高的保守性[1]。腦室內(nèi)或外周注射各種類型的KP都能促進(jìn)FSH和LH的釋放。除了在下丘腦表達(dá)外，kiss1和kiss1R也在小鼠[2]、大鼠[3]、綿羊[4]、恒河猴[5]等動(dòng)物的腺垂體中表達(dá)。Kisspeptin10能夠誘導(dǎo)FHSβ、LHβ基因的表達(dá)[2]，kisspeptin10能夠刺激體外培養(yǎng)的恒河猴腺垂體細(xì)胞LH和GH的釋放[5]。

另外，kiss1及kiss1R也在性腺當(dāng)中表達(dá)，它可能以旁分泌或自分泌的方式直接調(diào)控配子的發(fā)生。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)表明，外周注射不同類型的KP均能提高成年動(dòng)物體內(nèi)促性腺激素水平。成年雌性大鼠皮下注射或靜脈注射kisspeptin10能夠提高血漿FSH和LH的濃度[6]。給間情期的狗靜脈注射一劑kisspeptin10能夠以劑量依賴的方式(1～30 μg/kg)提高血漿中FSH、LH及雌激素的濃度[7]。以上這些結(jié)果都表明外周注射KP，能夠提高成年動(dòng)物血漿中促性腺激素水平，能夠激發(fā)性腺活力。然而，KP對(duì)初情期前動(dòng)物的影響還研究的比較少，KP處理是否能夠提前啟動(dòng)動(dòng)物的初情期，能否能夠激活動(dòng)物的繁殖軸尚未清楚?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究用kisspeptin10處理性成熟前的雌性小鼠，明確kisspeptin10對(duì)性成熟前小鼠生殖及生殖內(nèi)分泌的影響，并闡明其初步的作用機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】此研究以期為下一步研發(fā)灘羊非發(fā)情季節(jié)繁殖新技術(shù)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

Kisspeptin10多肽(Phoenixbiotech，048-56)，動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(TIANGEN，DP431)，Talent qPCR PreMix(TIANGEN，F(xiàn)P209-02)，Ttrizol(Invitrogen，15596026)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

2周齡ICR雌性小鼠80只，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心，按照中心標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)、管理。稱重、預(yù)飼養(yǎng)1周后2次稱重，挑選出32只體重和生長(zhǎng)速度趨于一致的32只小鼠用于后期試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。試驗(yàn)組分別每天上午8：00及晚上8：00皮下注射150 μL含不同濃度kisspeptin10(0.3、3、30 μg)的生理鹽水，并以注射150 μL生理鹽水作為對(duì)照組，連續(xù)注射7 d，在注射結(jié)束后第2天觀察記錄小鼠陰道口開張情況；眼眶采血，血液置于肝素鈉包被的1.5 mL離心管中，2000 r/min，離心8 min，分離血漿后置于-20 ℃保存；隨后，每一組小鼠采集垂體后分別置于含有1 mL Trizol的冷凍管中，然后立即置于液氮冷卻，最后放于-80 ℃冰箱保存；同時(shí)，分離小鼠兩側(cè)卵巢稱重，用游標(biāo)卡尺測(cè)定卵巢直徑并記錄。

1.4 小鼠垂體組織總RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄及熒光定量

將上述垂體組織室溫解凍，并用試劑盒自帶一次性研磨杵進(jìn)行研磨，然后用trizol法提取垂體總RNA；反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)引物(表1)對(duì)垂體GnRH-R、FSHβ、LHβ基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，總共35個(gè)循環(huán)。

表1 GnRH-R、FSHβ、LHβ基因的熒光定量引物

1.5 RIA法檢測(cè)生殖激素濃度

試驗(yàn)小鼠外周血中FSH及LH濃度委托北京華英生物技術(shù)研究所進(jìn)行激素RIA測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(M+SD)，運(yùn)用SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 垂體總RNA濃度與質(zhì)量檢測(cè)

圖1顯示，4組小鼠總RNA提取后測(cè)得核酸濃度分別為196、253、186、228 ng/mL，且OD260/OD280均在1.6～2.1，表明所提取的RNA無(wú)污染且RNA濃度可滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。RNA電泳后發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的(1泳道)、0.3 μg Kp處理組(2泳道)、3 μg KP處理組(3泳道)及30 μg KP處理組中所提取的小鼠垂體RNA完整、無(wú)降解。

圖1 RNA電泳圖

2.2 Kisspeptin處理對(duì)小鼠卵巢直徑、質(zhì)量及小鼠陰道開張的影響

由表2可見，KP處理初情期前的小鼠后能夠增加卵巢的平均質(zhì)量和直徑，皮下注射3 μg KP和30 μg KP均能顯著增加小鼠卵巢質(zhì)量和卵巢直徑(P<0.05)，且前者對(duì)卵巢的增重效果優(yōu)于后者，注射0.3 μg KP無(wú)論是對(duì)小鼠卵巢的重質(zhì)量還是卵巢直徑無(wú)顯著影響；在經(jīng)KP連續(xù)處理后，3 μg KP能夠顯著提高小鼠陰道開張率(P<0.05)，而其它濃度的KP均不能明顯促進(jìn)小鼠的陰道開張。

表2 不同濃度KP處理初情期前小鼠后對(duì)其卵巢質(zhì)量、直徑及陰道開張的影響

2.3 Kisspeptin處理初情期前小鼠外周血中生殖激素濃度變化

由圖2顯示，初情期前的小鼠經(jīng)KP連續(xù)處理一周后，與對(duì)照組相比，3 μg KP處理組中小鼠外周血中LH的濃度顯著增加(P<0.05)，而其它濃度的KP均不能明顯改變LH的濃度；與對(duì)照組相比，3 μg KP處理均能顯著提高小鼠外周血中FSH濃度(P<0.05)，而0.3 μg KP處理卻顯著降低血中FSH的濃度，30 μg KP處理對(duì)小鼠血中FSH濃度無(wú)顯著改變。

圖2 不同濃度的KP處理初情期前的小鼠后外周血中FSH和LH濃度變化

2.4 Kisspeptin處理初情期前小鼠后垂體相關(guān)基因表達(dá)

由圖3顯示，3 μg KP處理能夠顯著上調(diào)小鼠垂體中GnRH-R、FSHβ及LHβ基因表達(dá)(P<0.05)；而其它濃度KP對(duì)小鼠垂體GnRH-R、FSHβ及LHβ基因表達(dá)是復(fù)雜的，30 μg KP能顯著降低GnRH-R、FSHβ基因表達(dá)，而顯著上調(diào)LHβ基因的表達(dá)。另外，0.3 μg KP能夠顯著降低FSHβ及LHβ基因表達(dá)(P<0.05)。

圖3 KP處理對(duì)初情期前小鼠垂體相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

下丘腦GnRH脈沖性釋放的頻率和幅度均增加是動(dòng)物初情期啟動(dòng)的標(biāo)志，然而人們一直對(duì)調(diào)控GnRH釋放的上游因子知之甚少。在過去十多年的研究已經(jīng)明確KP是刺激GnRH釋放最重要的因子，諸多研究已經(jīng)表明完整的KP信號(hào)通路對(duì)哺乳動(dòng)物初情期啟動(dòng)是必須的，尤其是內(nèi)齒類和人類[8]。在人上kiss1或kiss1R基因突變會(huì)導(dǎo)致青春期異?；蛉狈η啻浩赱9]。本研究發(fā)現(xiàn)，初情期前的小鼠經(jīng)過連續(xù)一周皮下注射0.3 μg kisspeptin10能夠明顯的提高小鼠陰道開張率，提前啟動(dòng)小鼠的初情期。Daniel等[10]在給出生后21 d雌性大鼠腦室內(nèi)連續(xù)注射KP受體的拮抗劑P234 14 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠延后大鼠初情期的啟動(dòng)。Decourt等[11]給初情期前的小鼠每天注射合成的KP的類似物C6，連續(xù)5 d能夠明顯使其陰道開張?zhí)崆啊＿@些結(jié)果均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，這也進(jìn)一步證實(shí)了KP與哺乳動(dòng)物初情期啟動(dòng)關(guān)系密切。Wassie等[12]使用重組的裸質(zhì)粒pVAX-Kisspeptin-54-S-asd 疫苗免疫8周齡雄性羔羊后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性KP濃度顯著下降，并且與對(duì)照組相比，免疫組羔羊睪丸重量、睪丸的長(zhǎng)度和寬度明顯小于對(duì)照組的。結(jié)果也表明0.3 μg KP處理初情期前的小鼠后，其無(wú)論是卵巢質(zhì)量還是卵巢直徑均顯著增加，這也說(shuō)明KP在初情期前動(dòng)物生殖器官的發(fā)育中也可能起到非常重要的作用。而這種機(jī)制可能是KP作用于下丘腦-垂體刺激促性腺激素釋放，進(jìn)而間接促進(jìn)初情期之前動(dòng)物的生殖道進(jìn)一步發(fā)育，但是也不能排除KP可能直接作用于卵巢，促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育并激活卵巢功能。

已有研究表明，初情期前的大鼠皮下注射6.7 nmol metastin(kisspeptin54)不但能夠明顯增加外周血中FSH和LH的濃度，而且在PMSG預(yù)處理后能夠誘導(dǎo)其排卵[13]。Navarro等[14]給初情期前和成年雌性大鼠腦室內(nèi)注射或者外周注射(皮下或靜脈注射)kisspeptin10均可顯著增加血漿中FSH和LH濃度。Macedo等[15]使用牛kisspepin10處理初情期之前的小母牛，發(fā)現(xiàn)kisspepin10能夠以劑量依賴的方式增加其外周血中LH的濃度。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，皮下注射一定濃度的kisspeptin10能夠顯著增加初情期前小鼠外周血中FSH和LH的濃度。然而，這些生殖激素濃度的增加與KP濃度之間并無(wú)劑量依賴關(guān)系，推測(cè)可能與KP在高濃度時(shí)發(fā)生了脫敏反應(yīng)有關(guān)[16]。另外，低劑量的KP對(duì)小鼠垂體LH的分泌作用不顯著，但卻能夠顯著降低外周血中FSH濃度，其具體原因尚不清楚。

本結(jié)果也顯示，0.3 μg KP處理初情期前的大鼠可顯著上調(diào)垂體中FSHβ及LHβ基因的表達(dá)，而這種上調(diào)可能通過兩個(gè)方面進(jìn)行的。其一可能是KP直接作用于垂體促性腺細(xì)胞，并與之受體結(jié)合上調(diào)FSHβ及LHβ基因的表達(dá)。Zmijewska等[17]在體外培養(yǎng)的豬垂體前葉細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，KP能夠上調(diào)LHβ基因的表達(dá)，增加細(xì)胞LH的分泌。Witham等[18]在培養(yǎng)的原代小鼠腺垂體細(xì)胞和LβT2促性腺細(xì)胞系中均發(fā)現(xiàn)，添加KP可誘導(dǎo)FSHβ及LHβmRNA的表達(dá)。這些都與本試驗(yàn)結(jié)果一致。其二，可能KP與垂體前葉中GnRH-R相互作用，通過增加GnRH-R受體量來(lái)介導(dǎo)GnRH促進(jìn)FSHβ及LHβ基因的表達(dá)，從而增加垂體前葉促性腺激素的合成和釋放。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皮下注射適宜濃度的KP能夠顯著上調(diào)小鼠腺垂體中GnRH-R mRNA的表達(dá)。Mijiddorj等[19]也證實(shí)GnRH和KP可以在垂體上相互作用，KP可以上調(diào)垂體前葉促性腺細(xì)胞中GnRH-R基因的表達(dá)，從而調(diào)控垂體促性腺激素的釋放。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度KP連續(xù)處理初情期前小鼠可增加小鼠卵巢平均重量和直徑，提高小鼠陰道開張率，提前啟動(dòng)初情期；KP可能直接上調(diào)垂體前葉細(xì)胞中FSHβ及LHβ的表達(dá)或者通過間接上調(diào)GnRH-R mRNA的表達(dá)來(lái)增加初情期前小鼠外周血中促性腺激素濃度。然而，具體的分子機(jī)制還需做進(jìn)一步研究。