ATP6AP2基因的克隆與其表達(dá)載體的構(gòu)建

孫宜琳，劉淑芹，蔣揚帆，曾玲玲，楊細(xì)鳳，劉 杰

(湖北理工學(xué)院 腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435003)

0 引言

ATP6AP2基因(ATP酶輔助蛋白2)定位在 Xp11.4 染色體，編碼一種與腺苷三磷酸酶(ATP酶)相關(guān)的I型跨膜蛋白，對許多細(xì)胞過程至關(guān)重要，如蛋白質(zhì)運輸、成熟、再循環(huán)或降解[1-2]。ATP6AP2蛋白與ATPases- V(液泡型蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位ATP酶)的跨膜區(qū)功能有關(guān)，又稱為蛋白素受體(PRR)。作為V-ATPase輔助蛋白，參與了V-ATPase在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的組裝[3-4]。ATP6AP2最初被確定為腎素受體，在腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)中起到血壓調(diào)節(jié)的作用[5]。此外，ATP6AP2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)，其可能參與多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)生[6-7]。人類ATP6AP1和ATP6AP2的突變會導(dǎo)致多系統(tǒng)疾病，包括脂肪性肝炎、免疫缺陷和精神運動障礙[8-9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，ATP6AP2作為泛素化的底物之一參與了免疫調(diào)節(jié)類藥物抗腫瘤作用。為了確認(rèn)與ATP6AP2蛋白相結(jié)合的E3泛素連接酶，本文構(gòu)建了ATP6AP2-GFP表達(dá)載體，旨在為ATP6AP2的生物學(xué)功能提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 cDNA 的合成

1 mL TRIZOL 試劑裂解1皿293T 細(xì)胞，加入200 μL氯仿，劇烈震蕩，通過異丙醇沉淀法獲得RNA。1%瓊脂糖凝膠檢測RNA的完整性，Agilent Technologies 2100檢測RNA的質(zhì)量。取總RNA 3 μg，依次加入 Oligo(dT)1 μL，10 × BUFFER 2 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，10 mmol/L dNTP mix 1 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL，加ddH2O至總體積達(dá)到30 μL,混勻 42 ℃溫水浴 2 h,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80 ℃分裝，保存。

1.2 PCR 擴增ATP6AP2基因的片段

人源的ATP6AP2 基因CDS序列(NM_005765.3)來源于NCBI 數(shù)據(jù)庫( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。引物序列如下: ①上游引物 5'-CCGCTCGAGATGCAGTCTTTCCTGTCT-3'( 下劃線部分為 XhoⅠ酶切位點) ; ②下游引物5'-GCACTGCAGATCCATTCGAATCTTCTGGGTC -3'(下劃線部分為PST I酶切位點),擴增片段大小為1 053 bp。

以 293T 細(xì)胞 cDNA 為模板，PCR 擴增獲得 ATP6AP2 基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū) DNA 序列。 PCR 擴增條件為: 94 ℃預(yù)變性 5 min ; 95 ℃變性 30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，35 個循環(huán);72 ℃延伸 5 min;1% 瓊脂糖凝膠電泳回收 DNA 產(chǎn)物。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1酶切、酶連

ATP6AP2基因的PCR擴增產(chǎn)物通過 XhoⅠ和 PST雙酶切后與線性化的eGFP-N1載體連接。T4 DNA 連接酶 4 ℃過夜連接。酶切體系和連接體系見表1。

表1 酶切體系和連接體系 μL

1.3.2轉(zhuǎn)化

感受態(tài)大腸桿菌 TOP 10冰上放置待融化，取5 μL連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰上孵育30 min,42 ℃熱激120 s，之后冰上孵育3 min，加入600 μL無抗性LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床上培養(yǎng)2 h,取出，離心，倒掉上清，涂布平板。

1.3.3重組子鑒定

超凈臺中用滅菌牙簽挑取10個重組菌落于1.5 mL EP管中，加800 μL LB液體培養(yǎng)基于37 ℃搖床上搖菌培養(yǎng)3 h。菌液 PCR擴增條件為: 94 ℃ 預(yù)變性 5 min ;95 ℃ 變性 30 s，59 ℃ 退火 30 s， 72 ℃延伸 30 s，重復(fù) 28個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測陽性克隆,取陽性重組子進(jìn)一步用XhoⅠ和 PST酶對質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，將陽性重組質(zhì)粒送測序鑒定。菌液PCR體系見表2。

表2 菌液PCR體系 μL

1.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

將293T細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞密度為80%時開始轉(zhuǎn)染，用100 μL無血清培養(yǎng)基在EP管中稀釋2 μg重組質(zhì)粒，輕微混勻。取另一EP管用無血清培養(yǎng)基將4 μL脂溶液稀釋至100 μL，輕輕混勻，靜置5 min后與前一管混勻,靜置25 min, 然后于每孔中加入1 mL無血清培養(yǎng)基,置于5%CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱。DNA脂溶液孵育25 min后,轉(zhuǎn)移各管DNA脂溶液至6孔板中,搖勻,將6孔板放于5%CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育4 h后取出6孔板,吸取每孔中原培養(yǎng)基,加入2 mL新鮮的含血清培養(yǎng)基，48 h后取出6孔板,收獲細(xì)胞及上清液。

1.5 Western blot檢測ATP6AP2的表達(dá)

在收集轉(zhuǎn)染后6孔板中的細(xì)胞樣品中加入1 mL SDS-蛋白裂解液抽提蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用封閉液封閉1 h，浸泡在含GFP一抗的牛奶中，室溫?fù)u床上孵育1 h，之后4 ℃ 孵育12 h。第2 d取出PVDF膜，將一抗洗去，浸泡在含相應(yīng)二抗的牛奶中，室溫?fù)u床上孵育1 h，洗膜，經(jīng)顯影、定影后拍照。

2 結(jié)果

2.1 擴增目的基因片段

從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索得到人源ATP6AP2基因的信息(Gene ID: 10159)，其mRNA 序列號為NM_005765.3，基因全長為2 242 bp，CDS區(qū)起止位點為 97-1149 bp， 其序列如下：

從293T細(xì)胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄出cDNA后，PCR擴增人源ATP6AP2目的基因CDS序列。對照DNA分子Marker，擴增出預(yù)期大小1 053 bp的目的片段。目的基因的擴增產(chǎn)物如圖1所示。圖1中，5個泳道分別是5管PCR樣品，右側(cè)分子Marker顯示片段大小在1 000 bp左右。

圖1 目的基因的擴增產(chǎn)物

2.2 PCR產(chǎn)物和載體酶切、酶連、轉(zhuǎn)化

回收后的PCR產(chǎn)物與pEGFP-N1載體經(jīng)雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。轉(zhuǎn)化重組子涂布平板如圖2所示。圖2中，白色斑點為重組DNA菌落，LB固體培養(yǎng)基(卡那抗性)。

圖2 轉(zhuǎn)化重組子涂布平板

2.3 pEGFP-N1-ATP6AP2陽性重組子的鑒定

重組子中挑取2個菌斑搖菌后進(jìn)行菌液PCR鑒定,將菌液PCR呈陽性的菌落搖菌、提質(zhì)粒, 再經(jīng)XhoⅠ和 PST雙酶切后電泳，顯示酶切后線性化的載體以及插入的DNA片段。重組質(zhì)粒雙酶切驗證如圖3所示。從圖3可以看出，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切，得到一條4 700 bp的條帶以及1 053 bp的條帶，即ATP6AP2基因片段。酶切驗證顯示，ATP6AP2 基因成功地插入到pEGFP-N1載體中。將2個重組子提質(zhì)粒、送測序，測序結(jié)果通過 NCBI 上Blast比對分析顯示與 ATP6AP2基因編碼序列完全一致，陽性克隆命名為 pEGFP-N1-ATP6AP2。

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切驗證

2.4 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)

真核表達(dá)載體pEGFP- N1空載對照質(zhì)粒和pEGFP-ATP6AP2 重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后提取蛋白，用 Western blot 免疫印跡法檢測pEGFP-N1-ATP6AP2 融合蛋白的表達(dá)。pEGFP-N1-ATP6AP2融合蛋白的免疫印跡結(jié)果如圖4所示。圖4中，一抗為兔多抗GFP抗體；pEGFP-N1-1和pEGFP-N1-2分別表示轉(zhuǎn)染了pEGFP-N1空載的2個樣品；ATP6AP2-1 和ATP6AP2-2分別表示轉(zhuǎn)染了pEGFP-N1-ATP6AP2 重組質(zhì)粒的2個樣品。與 pEGFP-N1空載的對照樣品相比，在轉(zhuǎn)染了pEGFP-N1-ATP6AP2 重組質(zhì)粒的細(xì)胞中觀察到 63.5 kD處有1條特異條帶，即EGFP-ATP6AP2 融合蛋白，說明真核表達(dá)載體 pEGFP -N1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后顯著增加了ATP6AP2 蛋白的表達(dá)(內(nèi)參蛋白GAPDH 作為參照物)。

圖4 pEGFP-N1-ATP6AP2融合蛋白的免疫印跡結(jié)果

3 討論

多亞基泡型H+-ATPase(V-ATPase)腺苷三磷酸酶的生物合成是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中啟動的，由一組核心亞單位包括質(zhì)子孔(V0區(qū))和ATP水解域(V1區(qū))組成，此外，還有2個輔助亞單位命名為ATP6AP1和ATP6AP2。V-ATPase控制分泌和內(nèi)吞途徑中的一系列過程，如蛋白水解過程、蛋白降解、自噬和糖基化。此外，V-ATPase也參與了非酸化作用，如膜融合或分泌。

V-ATPase輔助亞基ATP6AP1的突變導(dǎo)致先天性糖基化障礙(CDG)、低丙種球蛋白血癥以及肝功能異常等臨床表現(xiàn)[10-11]。另一個輔助亞單位ATP6AP2的缺失導(dǎo)致小鼠心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞或足細(xì)胞V0亞單位的顯著減少、血清蛋白糖基化不足和自噬缺陷[12-13]。此外，ATP6AP2突變與帕金森病、痙攣、癲癇和智力殘疾等認(rèn)知障礙相關(guān)[14]。眾多研究表明，ATP6AP2外顯子跳躍突變通常會導(dǎo)致遲發(fā)性腦病例，如帕金森病和癲癇。然而，這些患者中沒有表現(xiàn)出任何明顯的肝臟、免疫或皮膚缺陷，其中一名患者的糖基化幾乎正常。與外顯子跳躍突變相比，錯義突變對ATP6AP2整體功能的影響更大。ATP6AP2管腔結(jié)構(gòu)域的不同點突變導(dǎo)致V-ATP酶組裝受損以及隨后的糖基化和自噬缺陷。患者出現(xiàn)肝病、免疫缺陷、皮膚松弛和精神運動障礙等臨床癥狀。這些結(jié)果表明，ATP6AP2缺乏癥的臨床表現(xiàn)取決于突變的嚴(yán)重程度[15]。然而，ATP6AP2如何在機制上促進(jìn)V-ATP酶功能從而影響糖基化以及自噬過程仍有待確定。

為了進(jìn)一步研究ATP6AP2的生物學(xué)功能，通過定向克隆的方法將人源ATP6AP2 連接到真核表達(dá)載體PEGFP-N1，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞高效表達(dá)EGFP-ATP6AP2 融合蛋白,為進(jìn)一步研究 ATP6AP2參與V-ATP酶功能的機制奠定了基礎(chǔ)。