拮抗劑方案新鮮單囊胚移植患者妊娠失敗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析

周 文，劉瑜亮，李 濤，邢衛(wèi)杰，張曦亞，歐建平

（1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州 510630；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州 510058）

輔助生殖的目標(biāo)是讓患者獲得健康的單胎活產(chǎn)兒［1-2］。新鮮周期單囊胚移植（fresh single blasto‐cyst transfer，F(xiàn)SBT）能維持妊娠率，降低多胎率，縮短患者從治療到妊娠的時(shí)間，是部分預(yù)后良好患者理想的胚胎移植策略［2］。研究［3］顯示，月經(jīng)規(guī)律的年輕患者使用拮抗劑方案促排后，F(xiàn)SBT 的種植率和單胎活產(chǎn)率顯著低于解凍囊胚，作者推測(cè)可能與刺激周期時(shí)內(nèi)膜與囊胚發(fā)育的不同步有關(guān)，并指出新鮮囊胚種植的生理機(jī)制和影響因素尚需更多研究。拮抗劑方案用藥周期短、用藥總劑量小、可降低卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)但不影響活產(chǎn)率而在臨床上廣泛使用。但目前關(guān)于拮抗劑方案促排后FSBT妊娠結(jié)局危險(xiǎn)預(yù)測(cè)因素的研究在國(guó)內(nèi)外都未見報(bào)道，為此，我們回顧性分析了本中心預(yù)后良好患者使用拮抗劑方案促排且行FSBT的相關(guān)資料，試圖找出臨床妊娠失敗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，為該方案的優(yōu)化使用及適宜人群的挑選提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象和分組情況

本研究已取得中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書?；仡櫺苑治?017 年1 月至2020 年4 月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行取卵手術(shù)的患者資料，納入標(biāo)準(zhǔn)：①女方年齡≤40 歲；②使用拮抗劑方案促排且獲卵數(shù)≥5 個(gè)；③新鮮周期第5 天單囊胚移植；④移植囊胚質(zhì)量為3BB及以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①取卵周期數(shù)大于3 次；②反復(fù)自然流產(chǎn)；③多囊卵巢綜合征或子宮異常；④睪丸取精的患者。

共有325 個(gè)治療周期納入該研究，臨床妊娠組172 例，未妊娠組153 例，比較兩組患者的基礎(chǔ)資料，促排情況，胚胎發(fā)育情況及移植囊胚的分期、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)外胚層質(zhì)量等。

1.2 促排方案及黃體支持

患者均使用拮抗劑方案，具體用法同前所述［4］。在月經(jīng)周期的第2～3 天使用Gn（果納芬，默克雪蘭諾，瑞士；或普麗康，默沙東，美國(guó)；或麗申寶，麗珠，中國(guó)珠海；或樂寶得，麗珠，中國(guó)珠海）啟動(dòng)，啟動(dòng)劑量根據(jù)患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、卵巢儲(chǔ)備及卵巢反應(yīng)性而定。在Gn 刺激4～5 d 后常規(guī)每天皮下注射拮抗劑0.25 mg（思則凱，默克雪蘭諾，瑞士；歐加利，默沙東，美國(guó)；固定方案），或者當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥14 mm，或E2≥400 pg∕mL 時(shí)，開始每天皮下注射拮抗劑0.25 mg 直至HCG 注射日（靈活方案），同時(shí)根據(jù)患者對(duì)藥物的反應(yīng)性及時(shí)調(diào)整Gn 劑量。當(dāng)2 個(gè)或2 個(gè)以上優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，于當(dāng)晚20：30～21：00注射HCG（麗珠，中國(guó)珠海）5 000～10 000 U或重組HCG（艾澤，默克雪蘭諾，瑞士）250 μg，34～36 h后取卵。取卵當(dāng)天起使用達(dá)芙通（雅培，美國(guó)）10 mg，每天2 次口服+雪諾酮（默克雪蘭諾，瑞士）90 mg，每天1 次陰道塞藥或黃體酮注射液40 mg，每天1 次肌注+安琪坦（法杏，法國(guó)）200 mg，每天2 次陰道塞藥進(jìn)行黃體支持直至驗(yàn)孕，若妊娠則繼續(xù)用藥至妊娠10周。

1.3 體外受精、胚胎培養(yǎng)及評(píng)估和胚胎移植

注射HCG 后36 h 取卵，取卵后4～6 h 授精?；颊呔翰捎妹芏忍荻入x心+上游法洗滌后使用常規(guī)體外受精（in vitro fertilization，IVF）或單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）受精。本中心ICSI 適應(yīng)證為：①嚴(yán)重少弱畸精子癥；②不明原因的前次IVF 完全不受精或受精率小于20%；③前次IVF 多精受精率較高且無可利用胚胎；④IVF患者精液處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)＜1×106。授精后16～18 h 觀察原核，67～69 h 進(jìn)行卵裂胚質(zhì)量評(píng)分。胚胎培養(yǎng)使用商品化序貫培養(yǎng)液（vitrolife，瑞典），在體積分?jǐn)?shù)為6% CO2，5%O2，89%N2培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行。卵裂期胚胎評(píng)分從卵裂球數(shù)目、卵裂球的均勻度、胚胎碎片比例3 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。按患者要求及本中心常規(guī)在第3 天冷凍1～2 枚優(yōu)質(zhì)或良好卵裂胚后，剩余胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。新鮮囊胚移植的患者行囊胚培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)為至少有4 枚6 細(xì)胞及以上，卵裂球均勻或中等均勻且碎片小于25%的卵裂胚。在受精后114～118 h，即第5 天上午，觀察囊胚形成情況并根據(jù)Gardner 分級(jí)對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)分，先根據(jù)囊胚腔的擴(kuò)張和孵出程度將囊胚分成1～6 期：1期，早期囊胚，囊胚腔體積小于囊胚總體積的一半；2 期，囊胚腔體積大于或等于囊胚總體積的一半；3期，完全擴(kuò)張囊胚，囊胚腔占據(jù)整個(gè)囊胚；4 期，擴(kuò)張后囊胚，囊胚腔體積較早期囊胚明顯擴(kuò)大，透明帶變??；5 期，正在孵化的囊胚，囊胚正在從透明帶破裂口孵出；6 期，孵化出的囊胚，囊胚完全從透明帶中脫出。3～6 期囊胚需對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞（trophectoderm，TE）進(jìn)行評(píng)分。ICM 評(píng)分：A 級(jí)，細(xì)胞數(shù)目多，結(jié)合緊密；B 級(jí)，細(xì)胞數(shù)目較少，結(jié)合較松散；C 級(jí)，細(xì)胞數(shù)目極少。TE 評(píng)分：A 級(jí)，細(xì)胞數(shù)目多，囊胚4 周均有細(xì)胞分布；B 級(jí)，細(xì)胞數(shù)目較少，滋養(yǎng)層細(xì)胞較松散；C 級(jí)，細(xì)胞數(shù)目極少。挑選出該患者最優(yōu)的一個(gè)3 期及以上的囊胚，在超聲引導(dǎo)下行單囊胚移植。移植后剩余的可利用囊胚行玻璃化冷凍或繼續(xù)培養(yǎng)至第6 天后再予以冷凍。若第5 天上午無3期及以上囊胚形成，則取消新鮮囊胚移植，胚胎繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)育到3期及以上時(shí)予以冷凍。

1.4 妊娠判斷

移植后14 d 查血β-hCG 陽性為生化妊娠，移植后5 周行陰道B 超檢查，超聲下見孕囊為臨床妊娠，本研究以臨床妊娠為主要觀察指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS23.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較使用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料均用頻數(shù)表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了篩選出臨床妊娠失敗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，將P＜0.1的變量即不孕類型、受精方式、Gn 使用天數(shù)、HCG注射日促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）水平、HCG 注射日促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）水平、移植囊胚的ICM 和TE 評(píng)分納入多因素Logistic 回歸模型，采用向后逐步法獲得調(diào)整后的OR值和95%CI。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基礎(chǔ)資料比較

兩組患者的資料總體符合近似正態(tài)且方差齊。臨床妊娠組和未妊娠組患者的基線資料見表1，兩組患者的女方年齡、男方年齡、平均周期數(shù)、BMI、不孕年限和不孕類型構(gòu)成差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組患者基礎(chǔ)資料比較Table 1 Basic information of patients ［（），n（%）］

表1 兩組患者基礎(chǔ)資料比較Table 1 Basic information of patients ［（），n（%）］

BMI：body mass index.

2.2 兩組患者臨床促排卵情況

兩組患者的臨床促排卵情況見表2，臨床妊娠組的促排天數(shù)（8.9±1.3）高于未妊娠組（8.6±1.2），HCG 日的FSH 水平（12.1±3.7）U∕L 低于未妊娠組（13.0±4.0）U∕L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 兩組患者臨床促排情況比較Table 2 Stimulation characteristics of patients ［（），n（%）］

FSH：follicle-stimulating hormone；LH：luteinizing hormone；AMH：anti-miüllerian hormone；Gn：gonadotrophins；E2：estradiol，HCG：human chorionic gonadotropin；ICSI：intracytoplasmic sperm injection；IVF：in vitro fertilization.

2.3 兩組患者胚胎發(fā)育及移植囊胚質(zhì)量比較

兩組患者的胚胎發(fā)育和移植的囊胚質(zhì)量情況見表3。受精方式、移植囊胚的ICM和TE評(píng)分在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 兩組患者胚胎發(fā)育及移植囊胚質(zhì)量比較Table 3 Comparison of embryo development and quality of transferred blastocyst［（），n（%）］

表3 兩組患者胚胎發(fā)育及移植囊胚質(zhì)量比較Table 3 Comparison of embryo development and quality of transferred blastocyst［（），n（%）］

ICSI：intracytoplasmic sperm injection；IVF：in vitro fertilization；ICM：inner cell mass；TE：tropheetoderm.

2.4 拮抗劑方案新鮮單囊胚移植臨床妊娠失敗的多因素回歸分析

將P＜0.1的變量即不孕類型、受精方式、Gn使用天數(shù)、HCG 注射日FSH 水平、HCG 注射日LH 水平、移植囊胚的ICM 和TE 評(píng)分納入多因素Logistic回歸模型后發(fā)現(xiàn)，移植囊胚的TE評(píng)分、Gn使用天數(shù)和受精方式是臨床妊娠失敗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表4）。

表4 拮抗劑方案新鮮周期單囊胚移植患者臨床妊娠失敗的多因素回歸分析Table4 Multivariate analysis of pregnancy failure in patients with fresh single blastocyst transfer and GnRH-ant protocol

3 討論

本研究使用多因素Logistic 回歸分析后發(fā)現(xiàn)，小于等于40 歲預(yù)后良好的患者使用拮抗劑方案促排卵并行新鮮單囊胚移植后，臨床妊娠失敗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素是較差的滋養(yǎng)外胚層評(píng)分［P=0.001，OR=2.173，95%CI：（1.359，3.476）］、較短的Gn 使用時(shí)間［P=0.015，OR=0.794，95%CI：（0.659，0.955）］和使用ICSI受精方式［P=0.024，OR=2.065，95%CI：（1.098，3.882）］。

關(guān)于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層形態(tài)對(duì)囊胚種植潛能的影響，一部分研究認(rèn)為滋養(yǎng)外胚層比內(nèi)細(xì)胞團(tuán)更能預(yù)測(cè)胚胎種植潛能［5］，另一部分研究則認(rèn)為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)更重要［6］。不同的研究結(jié)論可能與使用的胚胎培養(yǎng)液類型（單一或序貫）、培養(yǎng)方式（高氧或低氧）、移植周期類型（新鮮或解凍）和囊胚形態(tài)分級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一等有關(guān)。本研究中患者移植的囊胚評(píng)分均為3BB 及以上，多因素回歸分析后滋養(yǎng)外胚層評(píng)分為A 級(jí)的囊胚相對(duì)于評(píng)分為B 級(jí)的囊胚獲得臨床妊娠的OR 值為2.173，P=0.001，提示滋養(yǎng)外胚層質(zhì)量對(duì)胚胎的種植潛能影響更大。TE 在著床過程中的重要性可能歸因于它在這一關(guān)鍵階段中的以下作用：①它是胎盤及其附件的起源，②它促進(jìn)胚胎的孵化和子宮內(nèi)膜的侵襲［7］，③它通過分泌人絨毛膜促性腺激素（HCG）和誘導(dǎo)免

疫耐受來建立與母體免疫系統(tǒng)的聯(lián)系［8］。有研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)量越好的TE 分泌的HCG 水平越高且分泌的時(shí)間越早［9］。以上這些都證實(shí)數(shù)量多且形態(tài)好的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞可以讓囊胚更好地從透明帶孵出和植入子宮內(nèi)膜，會(huì)有更好的妊娠結(jié)局，與我們的研究結(jié)果一致。

本研究中臨床妊娠組的Gn 使用天數(shù)為（8.9±1.3）d，高于未妊娠組的（8.6±1.2）d，而兩組間的啟動(dòng)日構(gòu)成比、起始劑量和Gn 總劑量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示我們拮抗劑方案時(shí)Gn藥物劑量的調(diào)整和扳機(jī)時(shí)機(jī)的選擇非常重要。我們一般通過監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)卵泡的大小來決定扳機(jī)時(shí)機(jī)，本研究中當(dāng)2 個(gè)或2 個(gè)以上優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm 時(shí)注射HCG 觸發(fā)卵子最后成熟，當(dāng)患者的卵泡發(fā)育比較均勻時(shí)，優(yōu)勢(shì)卵泡的代表意義比較好，但是當(dāng)卵泡發(fā)育不均勻徑線差異較大時(shí)，使用該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行扳機(jī)似乎欠佳，尤其是拮抗劑方案，卵泡發(fā)育的同步性相對(duì)較差，所以Gn藥物劑量的調(diào)整和扳機(jī)日的確定需要臨床醫(yī)生具有豐富的經(jīng)驗(yàn)［10］。目前一些研究發(fā)現(xiàn)使用拮抗劑方案促排時(shí)，在傳統(tǒng)注射HCG 時(shí)機(jī)基礎(chǔ)上延遲1天注射可以獲得相似的臨床妊娠率［11-12］。對(duì)于擬行單囊胚移植的病人，卵巢對(duì)促排卵藥物的反應(yīng)較好，生長(zhǎng)的卵泡較多，適當(dāng)延遲HCG 注射時(shí)間可能使卵母細(xì)胞在卵巢內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育更充分，能兼顧大部分卵母細(xì)胞的成熟性，但是，延遲HCG 的注射時(shí)間對(duì)子宮內(nèi)膜的影響尚需進(jìn)一步研究。

本研究共325例，其中IVF 周期274例，臨床妊娠率為55.5%，ICSI 周期51 例，臨床妊娠率為39.2%，顯著低于IVF 周期。我們追蹤了ICSI 周期未妊娠的31 例患者首次行凍融胚胎移植的妊娠結(jié)局，有29例在研究期間進(jìn)行了凍融胚胎移植，17例獲得臨床妊娠，臨床妊娠率為58.6%。同時(shí)我們也比較了本中心在研究期間拮抗劑方案新鮮卵裂胚移植時(shí)IVF 和ICSI 的臨床妊娠率和種植率，臨床妊娠率分別為57.7%（345∕816）和56.9%（53∕123），種植率分別為30.1%（459∕1 523）和31.0%（70∕226），差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上數(shù)據(jù)提示我們ICSI 周期新鮮單囊胚移植較低的臨床妊娠率，可能與ICSI來源的囊胚發(fā)育特點(diǎn)及刺激周期的內(nèi)膜容受性有關(guān)。日本一項(xiàng)使用時(shí)差顯微成像系統(tǒng)記錄胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)的研究顯示，在將原核消失作為統(tǒng)一時(shí)間點(diǎn)后，卵裂胚階段IVF 和ICSI 的胚胎發(fā)育速度無差異，但到囊胚階段時(shí)，ICSI 比IVF 形成囊胚的時(shí)間延遲了3.2 h，形成完全擴(kuò)張期囊胚的時(shí)間延遲了5.7 h［13］。也有使用姐妹卵子分別行IVF 和IC‐SI 受精的對(duì)比研究顯示，在卵裂胚階段IVF 和ICSI具有相似的胚胎發(fā)育速度和質(zhì)量，但是到囊胚階段時(shí)IVF 比ICSI 具有更高的囊胚形成率，更快的發(fā)育速度和更好的囊胚質(zhì)量［14-16］。在內(nèi)膜方面，新鮮促排卵周期時(shí)子宮內(nèi)膜受高水平雌激素和孕激素影響，成熟發(fā)育相對(duì)提前，胚胎與內(nèi)膜發(fā)育的不同步可能會(huì)影響種植率［17-18］。本中心囊胚評(píng)分使用的是Gardner 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，未能對(duì)囊胚的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，且評(píng)分帶有主觀性；本中心IVF 周期的授精時(shí)間統(tǒng)一為13：00，而ICSI 周期的授精時(shí)間約為15：00，比IVF 周期延遲了約2 h，我們推測(cè)這種胚胎發(fā)育與內(nèi)膜成熟的不同步在ICSI 周期新鮮囊胚移植時(shí)可能更明顯；另外，ICSI 周期延遲兩小時(shí)授精，可能會(huì)導(dǎo)致卵子在體外過熟，錯(cuò)過了最佳授精時(shí)間，降低了后續(xù)胚胎的發(fā)育潛能。以上可能皆與較低的ICSI 新鮮囊胚移植妊娠率有關(guān)。同時(shí)我們也注意到本研究中ICSI 僅51 個(gè)周期，例數(shù)偏少，所以還需要更長(zhǎng)時(shí)間和更多樣本量的研究。

本文的不足之處為，是單中心的回顧性研究且樣本量不夠大，另外我們是以臨床妊娠為主要觀察指標(biāo)，未能全部追蹤到活產(chǎn)結(jié)局，所以尚需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行長(zhǎng)期的觀察研究。

總之，我們的結(jié)果提示，≤40 歲預(yù)后良好的患者使用拮抗劑促排并進(jìn)行新鮮單囊胚移植時(shí)，較差的滋養(yǎng)外胚層評(píng)分，較短的Gn 使用時(shí)間和使用IC‐SI受精方式是臨床妊娠失敗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。