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    用于3種農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的熒光免疫芯片研發(fā)及其應(yīng)用

    2021-08-03 00:32:30崔海峰賈芳芳陳立軍武妹霞惠光朋何方洋
    山東畜牧獸醫(yī) 2021年7期
    關(guān)鍵詞:滅蠅百威偶聯(lián)

    崔海峰,賈芳芳,陳立軍,武妹霞,惠光朋,何方洋*

    (1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司,北京 102206;2.北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心,北京;3.河北省灤州市農(nóng)業(yè)村局,河北 灤州)

    我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國,農(nóng)藥使用品種多、用量大,可以有效保障或提高農(nóng)作物產(chǎn)量[1],但長(zhǎng)期大規(guī)模不合理使用,會(huì)造成食用農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留,損害消費(fèi)者的身體健康;另一方面,農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用,還會(huì)不可避免地殘留在飼料當(dāng)中,致使其進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi),降低動(dòng)物的生長(zhǎng)性能,嚴(yán)重者可危害動(dòng)物健康甚至導(dǎo)致動(dòng)物死亡,且殘留在動(dòng)物產(chǎn)品中的農(nóng)藥也可能危害人類健康[2]。目前針對(duì)農(nóng)藥殘留及其代謝物的檢測(cè)主要是依靠色譜法、質(zhì)譜法等儀器分析手段[3-6],專屬性強(qiáng),靈敏度高,可實(shí)現(xiàn)定性與定量分析,但檢測(cè)費(fèi)用高、周期長(zhǎng),且需要專門的操作人員,不適用于對(duì)大量樣品進(jìn)行低成本快速篩選。而免疫分析技術(shù)因其操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn),已成為最具應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿Φ姆治黾夹g(shù)之一[7]。

    常見的免疫分析方法主要有酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫層析技術(shù)。趙妍等[8]建立了擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法,對(duì) 8種擬除蟲菊酯具有較高的靈敏度,IC50范圍在8.69 ~ 344.97 ng/ml;LAN 等[9]基于廣譜特異性單克隆抗體,建立了同時(shí)檢測(cè)蔬菜水果中克百威及其代謝物 3-羥基克百威的 ELSIA方法;周嘉明等[10]建立了基于膠體金免疫層析法的三氯殺螨醇快速檢測(cè)試紙條的研制方法,其對(duì)茶葉中三氯殺螨醇檢測(cè)限為0.2 mg/kg,檢測(cè)時(shí)間8 min;Sheng等[11]建立了乙氧氟草醚直接和間接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨熒光免疫分析法,IC50分別為 10.27 ng/ml和2.76 ng/ml。以上建立的用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)ELISA方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高,但仍需較為繁瑣的操作步驟,檢測(cè)速度相對(duì)較慢,不能完全滿足農(nóng)藥殘留現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的要求。相對(duì)而言,免疫層析技術(shù)檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單,而且熒光層析法的靈敏度和準(zhǔn)確性較膠體金法更勝一籌[12]。因此,本研究將時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)和生物芯片技術(shù)相結(jié)合,研制了 3種農(nóng)藥多殘留快速檢測(cè)免疫芯片,以滿足農(nóng)藥多殘留現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的需求。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 檢測(cè)材料 胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨等果蔬加工副產(chǎn)品類飼料,購自于北京某超市。

    1.1.2 儀器 克百威-卵清蛋白偶聯(lián)物、克百威單克隆抗體,毒死蜱-卵清蛋白偶聯(lián)物、毒死蜱單克隆抗體,滅蠅胺-卵清蛋白偶聯(lián)物、滅蠅胺單克隆抗體,北京勤邦生物技術(shù)有限公司自制;克百威標(biāo)準(zhǔn)品、毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品、滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品,純度>98.0 %,美國Sigma公司;FT04C時(shí)間分辨熒光微球(表面連接有-COOH基團(tuán),激發(fā)波長(zhǎng)360 nm,發(fā)射波長(zhǎng) 615 nm),蘇州為度生物技術(shù)有限公司;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物(MES)、雞 IgY、羊抗雞IgY,美國Sigma公司;硝酸纖維素膜(NC膜),德國 Sartorius公司;樣品墊、吸水墊、PVC底板,上海捷寧生物科技有限公司。LGJ-50C冷凍干燥機(jī),北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;XYZ3050膠體金點(diǎn)樣系統(tǒng),美國 BIODOT公司;AQ4200數(shù)控感應(yīng)斬切機(jī),上海金標(biāo)生物科技有限公司;KQ2200超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;M8多功能振蕩混合器,上海邁皋科學(xué)儀器有限公司;芯片分析儀,北京勤邦生物技術(shù)有限公司;高速冷凍離心機(jī),湘儀離心機(jī)儀器有限公司;低速離心機(jī),北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 溶液配制 活化緩沖液:0.05 mol/L MES,pH6.0。偶聯(lián)緩沖液:0.05 mol/L硼酸鹽緩沖液(BB),pH 8.0。洗滌緩沖液:0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(PB),pH 7.4。封閉緩沖液:含0.04 mol/L鹽酸羥胺及 1 % 酪蛋白的中性 PB。貯存緩沖液:含0.05 % Proclin 300及0.1 % 酪蛋白的中性PB。樣本提取液:0.02 mol/L PB + 5 %甲醇。

    1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

    (1)熒光微球標(biāo)記抗體的制備:①活化:取 50 μl 300 nm粒徑的熒光微球懸液,用活化緩沖液 MES 10倍稀釋后,等量分裝于棕色避光離心管中,渦旋混勻,12 000 r/min、4 ℃ 離心15 min,棄上清;同法用MES洗滌1次,離心棄上清。稱取EDC和NHS各10 mg,分別用1 ml MES溶解后,取 5 μl EDC溶液及 20 μl NHS溶液加入離心管中,補(bǔ)加 MES重懸至離心前體積,200次/min振蕩,室溫反應(yīng) 15 min。②偶聯(lián):活化處理后的微球懸液 12 000 r/min、4 ℃離心15 min,棄上清;用BB洗滌1次,離心棄上清。取克百威、毒死蜱、滅蠅胺單克隆抗體(檢測(cè)用)及雞IgY(質(zhì)控用),使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后,分別以 0.2~0.8 mg/ml的添加量加入各離心管中,以 BB作為稀釋液,重懸各份熒光微球至離心前體積,200次/min震蕩,室溫反應(yīng) 4 h。③封閉:偶聯(lián)結(jié)束后的微球懸液 12 000 r/min、4 ℃ 離心 15 min,棄上清;用封閉緩沖液重懸至離心前體積,200次/min振蕩,室溫反應(yīng) 1 h。④貯存:封閉結(jié)束后的微球偶聯(lián)物懸液 12 000 r/min、4 ℃ 離心 15 min,棄上清;用 PB洗滌 1次,離心棄上清。洗滌后的微球偶聯(lián)物用貯存緩沖液洗滌 2次,重懸至離心前體積,4 ℃ 避光保存?zhèn)溆谩?/p>

    (2)檢測(cè)試劑的制備:按適當(dāng)比例稀釋、混勻檢測(cè)微球與質(zhì)控微球的偶聯(lián)物懸液,即制成熒光微球檢測(cè)試劑。平底管中添加 100 μl稀釋懸液,-50 ℃ 預(yù)凍 3 h,真空干燥 15 h,取出后加蓋、加干燥劑密封,置4 ℃ 避光保存。

    (3)熒光免疫芯片的制備:如圖 1所示,將一定濃度的克百威-卵清蛋白偶聯(lián)物(檢測(cè)線,T1)、毒死蜱-卵清蛋白偶聯(lián)物(檢測(cè)線,T2)、滅蠅胺-卵清蛋白偶聯(lián)物(檢測(cè)線,T3)和羊抗雞 IgY(質(zhì)控線,C線)分別點(diǎn)陣包被在 NC膜上,并根據(jù)層析方向由下至上,將樣品墊、NC膜、吸水墊依次粘貼于 PVC底板上,將組裝好的板條切割成寬為 8 mm的試紙條,加干燥劑封裝備用。

    圖1 熒光免疫芯片結(jié)構(gòu)圖

    (4)樣品處理與檢測(cè):取新鮮樣品擦去泥土,剪碎成小于 1 cm 見方的碎片,稱取 2.00±0.05 g樣品至 10 ml聚苯乙烯離心管中,加入4 ml樣本提取液,振蕩 30 s,靜置 1 min,吸取400 μl上層液體加入制備的檢測(cè)試劑中,連續(xù)吹打 5次混勻,靜置 3 min,即為樣品待檢液。將制備的熒光免疫芯片插入檢測(cè)試劑中,室溫反應(yīng)5 min,用芯片分析儀讀取 T、C線的熒光強(qiáng)度,計(jì)算 T/C值,T/C≥1,判為陰性(-);T/C<1,判為陽性(+)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 檢測(cè)限

    在空白新鮮胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨樣品中分別添加克百威、毒死蜱、滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品至表1所列的濃度,用免疫芯片進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)濃度重復(fù) 3次,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定樣本檢測(cè)限。由表1結(jié)果可知,當(dāng)樣品中克百威、毒死蜱、滅蠅胺濃度分別為 0.02 mg/kg、0.5 mg/kg、0.5 mg/kg時(shí),各農(nóng)藥對(duì)應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果為陽性,因此確定該熒光免疫芯片的檢測(cè)限為:克百威 0.02 mg/kg、毒死蜱0.5 mg/kg、滅蠅胺0.5 mg/kg。

    表1 檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

    2.2 特異性

    取空白新鮮胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨各 1份,在其中分別添加其他常見的 10種農(nóng)藥至濃度為 10 mg/kg,用免疫芯片進(jìn)行檢測(cè),每種藥物重復(fù)3次,判定芯片的特異性。由表2可知,樣本中常見的其他農(nóng)藥對(duì) 3個(gè)點(diǎn)陣條帶均不產(chǎn)生干擾,結(jié)果都顯示陰性,說明本芯片對(duì) 3種藥物特異性較好。

    表2 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

    2.3 準(zhǔn)確性

    取空白新鮮胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨樣品各10份,分別添加3種農(nóng)藥至2.1確定的檢測(cè)限濃度,用免疫芯片進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)濃度重復(fù) 3次,計(jì)算假陽性率和假陰性率,結(jié)果見表 3。由結(jié)果可知,對(duì)陰性樣本、陽性樣本進(jìn)行檢測(cè),無假陽性、假陰性出現(xiàn),結(jié)果判定準(zhǔn)確,說明本免疫芯片可以對(duì)果蔬樣本中的克百威、毒死蜱、滅蠅胺3種農(nóng)藥同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確定性分析。

    表3 準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

    2.4 關(guān)于動(dòng)物飼料方面檢測(cè)的適用性

    由于市場(chǎng)需求,本研究暫時(shí)只測(cè)定了胡蘿卜、花椰菜、蘋果、梨等果蔬加工副產(chǎn)品類飼料樣本,后續(xù)研究還會(huì)增加樣本進(jìn)行測(cè)定。本研究制備的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)熒光免疫芯片,只需要根據(jù)樣本特點(diǎn)調(diào)整其前處理方法,即能夠檢測(cè)出該樣本的農(nóng)藥殘留量,因此,本芯片對(duì)于其他動(dòng)物飼料方面的檢測(cè),同樣適用。

    3 結(jié)論

    時(shí)間分辨免疫熒光是20世紀(jì)80年代在傳統(tǒng)免疫分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的標(biāo)記免疫分析技術(shù),使用具有獨(dú)特?zé)晒馓卣鞯蔫|系元素及其螯合物,靈敏度高、特異性好、無放射元素污染[13];生物芯片技術(shù)是采用微量點(diǎn)樣等方法,將生物大分子有序地固化在載體表面組成密集的點(diǎn)陣列,具有高通量、反應(yīng)速度快等特點(diǎn)[14]。本研究將時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)和生物芯片技術(shù)相結(jié)合,以硝酸纖維素膜為載體,農(nóng)藥抗原為捕獲探針,制作了一種包含 3種抗原抗體組合的免疫芯片,可同時(shí)檢測(cè)甲克百威、毒死蜱、滅蠅胺,檢測(cè)限分別為 0.02 mg/kg、0.5 mg/kg、0.5 mg/kg,假陰性率、假陽性率均為 0,準(zhǔn)確度較高;對(duì)常見的其他 10種農(nóng)藥無交叉反應(yīng),特異性較好;檢測(cè)速度快,從制樣到得出結(jié)果僅需15 min。本方法將傳統(tǒng)試紙條的劃線模式改成點(diǎn)陣形式,可以有效避免劃線引起的多項(xiàng)目之間的顯色干擾。該方法作為一種快速篩查手段,可廣泛用于果蔬加工副產(chǎn)品類飼料中多種農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場(chǎng)篩查和檢測(cè),具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。

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