蒙藥山沉香抗心肌缺血及其作用機(jī)制研究

張冬艷，陸景坤，張 燁，孫 鵬，張 烜，薛培鳳

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2.西安市第三醫(yī)院藥劑科）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是心肌的急性壞死性損傷，在發(fā)達(dá)國家可能是導(dǎo)致死亡的主要原因[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，每年約有1200萬人死于MI[2]。缺血性心臟病主要是由冠狀動脈循環(huán)改變引起的心肌缺血缺氧導(dǎo)致的[3]。當(dāng)冠狀動脈供血或供氧不足，不能滿足心肌代謝的需要時，就會造成不可逆的心肌損傷[4]。雖然目前缺血性心臟病主要是以化學(xué)藥物或機(jī)械手段進(jìn)行控制和治療，但傳統(tǒng)醫(yī)藥具有多成分、多靶點(diǎn)、療效多樣的特點(diǎn)，同樣被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的臨床治療[5]，并且在該領(lǐng)域顯示出廣闊的前景[6，7]。

蒙藥山沉香是一種蒙醫(yī)常用藥，為木樨科丁香屬植物羽葉丁香（Syringa pinnatifolia Hemsl.var.alashanensis Ma.et.S.Q.Zhou）的根、莖和粗枝，又名賀蘭山丁香，蒙藥名阿拉善-阿嘎如[8]。山沉香有鎮(zhèn)赫依、清熱、止痛、平喘的功效[9]，主要用于治療胸悶氣短、心肌缺血等心肺疾病，多與其他蒙藥配伍使用[10]?，F(xiàn)代藥理研究主要集中于其抗心肌缺血作用[11-14]，有文獻(xiàn)報道山沉香揮發(fā)油[11]、醇提物均可改善大鼠（或小鼠）心肌缺血癥狀[12，13]，山沉香超微粉也可改善大鼠急性心肌缺血各項(xiàng)指標(biāo)[14]。

本研究分別給予Wistar大鼠山沉香原粉、醇提物、揮發(fā)油、醇提物+揮發(fā)油，并采用ISO誘導(dǎo)急性心肌缺血的模型，初步評價山沉香對心肌缺血的治療作用、活性部位及其可能的作用機(jī)制，為該蒙藥作為抗心肌缺血藥物應(yīng)用于臨床提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材

山沉香藥材購自呼和浩特藥材總公司，經(jīng)鑒定為羽葉丁香（Syringa pinnatifolia Hemsl.var.alashanensis Ma.et.S.Q.Zhou）去皮的莖和枝干。

1.2 實(shí)驗(yàn)試藥

異丙腎上腺素（上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司），蘇木精、伊紅（西力生物），總RNA提取試劑盒（澤生試劑耗材），Trizol試劑盒（TaKaRa公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

健康Wistar雄性大鼠，體重（200±20）g，（動物許可證號SCXK（京）2006-0009，北京維通利華公司）。

1.4 儀器

BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)多道生理記錄儀（成都泰盟軟件有限公司），F(xiàn)A1104電子分析天平（上海?？惦娮觾x器廠），包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、攤片機(jī)、烘片機(jī)（德國Leica公司），光學(xué)顯微鏡（德國Leica公司，連接LAS V4.5圖像分析軟件），PCR儀（美國Applied Biosystems公司），臺式低溫離心機(jī)（德國EPPENDORF公司），恒溫振蕩器（江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），電泳設(shè)備（美國BIO-RAD），凝膠成像系統(tǒng)（champGel 5000）。

2 方法

2.1 藥材制備

600g山沉香原藥材經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過80目篩，得山沉香原粉，等量分成3份，各200g。200g干燥山沉香藥材粗粉加入6倍量95%乙醇，加熱回流提取3次，每次2h，然后合并濾液，60℃水浴揮發(fā)至無醇味，將所得浸膏真空干燥至完全干燥，研磨成粉末后過80目篩，得山沉香醇提物粉37.04g。200g干燥山沉香藥材粗粉加入蒸餾水至沒過藥材，用揮發(fā)油提取器提取，得山沉香揮發(fā)油0.62g。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理

65只大鼠隨機(jī)分為7組：空白對照組（10只），模型組（10只），陽性對照組（普萘洛爾10mg.kg-1，9只），山沉香原粉組（1.62g.kg-1，9只），山沉香醇提物組（0.3g.kg-1，9只），山沉香揮發(fā)油組（5.5mg.kg-1，9只），山沉香醇提物+揮發(fā)油組（劑量按1：1配比，9只），空白對照組和模型組灌胃同等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），山沉香原粉、醇提物及揮發(fā)油劑量按同等質(zhì)量原粉中提取醇提物和揮發(fā)油克數(shù)折算所得。各組每日灌胃一次，連續(xù)灌胃9天。

2.3 造模方法

皮下注射ISO（85mg.kg-1）造成大鼠急性心肌缺血的模型[15]，除空白對照組外，其余各組均在第8天和第9天灌胃1h后，腹部皮下注射ISO（85mg.kg-1）。

2.4 心電圖監(jiān)測

大鼠用5%水合氯醛麻醉后仰臥固定，用針電極鉗夾住四肢，采用標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)連續(xù)進(jìn)行心電監(jiān)測。末次注射ISO（85mg.kg-1）后，實(shí)時監(jiān)測大鼠體表肢導(dǎo)聯(lián)心電圖，持續(xù)動態(tài)觀察大鼠心電圖的變化，每只大鼠采集15min，采集圖像后觀察并比較各組心電圖變化差異。

2.5 心臟病理組織檢測

取各組大鼠心臟，生理鹽水沖洗至無血色，在10%福爾馬林液中固定48h以上后，采用HE染色法觀察心肌組織的病理變化情況。

2.6 心臟組織中Bax、Bcl-2的表達(dá)

將心臟組織在研缽中磨碎，每50～100mg組織加1ml裂解液，按照Trizol試劑盒和總RNA提取試劑盒的操作方法，提取各組大鼠心肌組織總RNA，設(shè)計引物后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

選用GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列分別為：GAPDH上游引物序列5'-CGGCAAGTTCAACGGCACAGTCA-3'，下游引物序列5'-CACAAACATGGGGGCATCAGCGG-3；Bax上游引物序列5'-CCAGGACGCATCCACCAAGAA-3'，下游引物序列5'-AGTGTCCAGCCCATGATGGTTC-3'；Bcl-2上游引物序列5'-CCCCTGGCATCTTCTCCTTC-3'，下游引物序列5'-CCTGAAGAGTTCCTCCACCACC-3'。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度條件為37℃15min，85℃5s，溫度降至4℃后取出，其產(chǎn)物cDNA于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)溫度條件為94℃5min初變性，然后94℃30s，56℃30s，72℃30s，72℃延伸7min，共完成35個循環(huán)。對擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外條件下，采集凝膠圖像，Image J軟件對圖像進(jìn)行灰度值分析。

2.7 統(tǒng)計方法

各組大鼠心電圖監(jiān)測結(jié)果采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用SPSS 20.0軟件對各組大鼠Bcl-2/Bax灰度值比值進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 山沉香對大鼠急性心肌缺血心電圖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。各組大鼠典型心電圖見圖1。與空白對照組比較，其他各組S-T段均有所抬高。模型組大鼠心電圖表現(xiàn)出明顯波形改變，S-T段異常抬高；各給藥組與模型組比較，急性心肌缺血心電圖表現(xiàn)均有所改善。以心電異常率為指標(biāo)，結(jié)果顯示：醇提物組與模型組相比，心電異常率經(jīng)卡方檢驗(yàn)，χ2=2.686，P=0.005（P＜0.01）；醇提物+揮發(fā)油組、揮發(fā)油組心電異常率均為66.67%，兩組與模型組相比，χ2=0.465，P=0.303（P＞0.05）；原粉組與模型組相比，χ2=2.686，P=0.057（P＞0.05）。統(tǒng)計結(jié)果表明：與其他給藥組相比，山沉香醇提物對大鼠急性心肌缺血時S-T段的抬高具有更為明顯的治療作用，且與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明山沉香醇提物對ISO所致的大鼠急性心肌缺血治療作用最顯著。

圖1 各組大鼠典型心電圖Fig1 Typical ECGs in each group

表1 山沉香對大鼠急性心肌缺血心電圖的影響Tab.1 The effect of Syringa pinnatifolia on ECG of acute myocardial ischemia in rats

3.2 山沉香對急性心肌缺血大鼠心肌組織病理變化的影響

在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織HE染色切片，結(jié)果見圖2。由圖可見，空白對照組大鼠心肌細(xì)胞完整，排列整齊規(guī)則，橫紋及肌小節(jié)清晰可見。心肌細(xì)胞著色均勻，細(xì)胞核形態(tài)正常、無固縮，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞界限清晰（見圖2A）。模型組大鼠心臟組織心肌纖維損傷呈彌漫大片狀（見圖2B）。陽性對照組（普萘洛爾組）心肌細(xì)胞排列整齊規(guī)則，橫紋清晰。少有炎細(xì)胞浸潤，著色略不均勻，心肌纖維間隙稍大（見圖2C）。山沉香揮發(fā)油組大鼠心肌纖維間隙增大，部分區(qū)域著色不均勻，間質(zhì)血管內(nèi)有輕度出血（見圖2D）。醇提物組心肌缺血改善明顯，心肌細(xì)胞排列整齊規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，橫紋清晰可辨（見圖2E）。原粉組病變較輕，胞質(zhì)輕度水腫、深染，心肌纖維間隙較大（見圖2F）。醇提物+揮發(fā)油組大部分心肌細(xì)胞完整、無異常，著色輕度不均勻，心肌纖維間隙較大，少部分溶解斷裂（見圖2G）。

圖2 各組大鼠心肌組織典型病理變化（400×）Fig2 The typical pathological changes of myocardial tissue in each group（400×）

3.3 山沉香對缺血心臟組織中Bax、Bcl-2的表達(dá)變化的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。陰性組僅加入輔助試劑，未加入各組大鼠心臟組織PCR產(chǎn)物或引物試劑，作為陰性對照。由圖可見，除陰性組外所有樣本中GAPDH均有表達(dá)，模型組Bcl-2表達(dá)較弱，醇提物組、醇提物+揮發(fā)油組Bax表達(dá)較弱。

圖3 Bax、Bcl-2及GAPDH的凝膠圖像Fig3 The gel images of Bax,Bcl-2 and GAPDH

對采集的凝膠圖像，采用Image J軟件對圖像進(jìn)行灰度值分析后，計算Bcl-2/Bax比值。由圖4可見，除揮發(fā)油組外，山沉香其他各處理組Bcl-2/Bax比值顯著高于模型組（P＜0.05），其中醇提物組Bcl-2/Bax比值顯著高于其他組（P＜0.001）。

圖4 各組大鼠Bcl-2/Bax值比較Fig4 Comparison of Bcl-2/Bax values in each group

4 討論與結(jié)論

ISO是一種β腎上腺素受體激動劑，當(dāng)大劑量的ISO注射到動物體內(nèi)時，會引起類似于人類心肌缺血的癥狀，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量耗竭和不可逆的細(xì)胞損傷。因此，利用ISO建立MI模型已被各種藥物研究所采用[16]，其劑量參照文獻(xiàn)選擇[15]。

心電圖的相關(guān)表現(xiàn)是診斷MI的重要標(biāo)準(zhǔn)。ST段抬高或壓低區(qū)別缺血或非缺血。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了ISO組的大鼠心電圖ST段明顯升高，這可能與心肌缺血或壞死等因素有關(guān)[16]。山沉香各處理組成功地改善了ISO誘導(dǎo)的心電圖異常，說明山沉香對心肌缺血損傷具有保護(hù)作用。

HE染色是評估心肌損傷的重要方法[17]。組織病理學(xué)檢查進(jìn)一步證實(shí)了心電圖監(jiān)測的結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)心肌梗死的主要病理表現(xiàn)為損傷區(qū)域心肌纖維間隙增大，排列紊亂、扭曲，溶解斷裂，水腫明顯，橫紋不清甚至消失，間質(zhì)血管內(nèi)充血、出血，淋巴細(xì)胞浸潤等。山沉香各處理組治療后上述病理表現(xiàn)明顯改善。以上結(jié)果表明，山沉香能有效改善ISO誘導(dǎo)的心肌梗死。

大劑量的ISO也會導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生和抗氧化酶系統(tǒng)的喪失。氧化應(yīng)激通過直接或間接的機(jī)制介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心肌梗死[16]。Bcl-2蛋白家族被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。Bcl-2家族包括促凋亡蛋白（Bax）和抗凋亡蛋白（Bcl-2）[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，山沉香各處理組Bcl-2/Bax比值顯著高于ISO模型組（P＜0.05），其中醇提物組Bcl-2/Bax比值顯著高于其他組（P＜0.001）。

本研究采用不同的方式對山沉香藥材進(jìn)行處理，得到山沉香原粉、醇提物及揮發(fā)油，比較了各組對大鼠急性心肌缺血的治療作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)醇提物的作用最顯著，表明醇提物可能是山沉香治療心肌缺血的主要活性部位。但要具體到更小的活性部位或某些活性成分，還需要利用化學(xué)手段進(jìn)一步去除無效或有害成分，結(jié)合更加廣泛的體內(nèi)及體外試驗(yàn)，才能逐漸明確。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明山沉香可能是通過上調(diào)抗凋亡因子（Bcl-2）和下調(diào)促凋亡蛋白（Bax）來保護(hù)心肌細(xì)胞，抑制細(xì)胞凋亡?？紤]到傳統(tǒng)醫(yī)藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，山沉香也有可能通過其他炎癥或凋亡途徑發(fā)揮抗心肌缺血作用。因此，未來需要更多更深入的研究，才能更加明確山沉香抗心肌缺血的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，完善其作用機(jī)制。