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    胞外聚合物在腐敗希瓦氏菌處理鈾污染地下水中的作用

    2021-08-02 03:31:42黃鳳羽張海玲王永鵬易發(fā)成
    原子能科學(xué)技術(shù) 2021年8期
    關(guān)鍵詞:希瓦氏菌菌體

    黃鳳羽,張海玲,王永鵬,王 哲,*,易發(fā)成,曾 錚

    (1.西南科技大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院,四川 綿陽 621010;2.中國工程物理研究院 材料研究所,四川 江油 621700)

    鈾礦開采和礦山尾礦會對鄰近地下水造成鈾污染,其鈾含量高達(dá)50 mg/L[1]。由于鈾的重金屬毒性和放射性危害,含鈾地下水的處理一直以來都受到廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)的處理方式主要是物理化學(xué)方法(混凝沉淀法[2]、離子交換法[3]、吸附法[4]、膜分離法[5]等),在去除含鈾地下水的同時通常有難以再生或二次污染等缺點(diǎn)[6-7]。微生物原位處理技術(shù)有原料充足、成本低、處理效率高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),越來越受到人們的重視[8-10]。微生物對鈾的去除已有廣泛的研究,厭氧顆粒污泥[11]、硫酸鹽還原菌、希瓦氏菌和假單胞菌等[12-14]都被證明對降低地下水中的鈾濃度具有長期有效性。微生物固定鈾的4個基本機(jī)制為:1) 微生物將U(Ⅵ)還原沉淀為U(Ⅳ);2) 細(xì)胞對U(Ⅵ)的吸收和積累;3) 微生物細(xì)胞表面對鈾的吸附;4) 細(xì)胞釋放的無機(jī)磷酸鹽與U(Ⅵ)配位沉淀[15-17]。

    1 實(shí)驗

    1.1 主要試劑與儀器

    腐敗希瓦氏菌(22940),中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;DOWEX MARATHON C陽離子交換樹脂(CER,20~50目)、乳酸鈉(99.0%),美國Sigma-Aldrich;UO2SO4·3H2O(99.99%),湖北楚盛威化工有限公司,配制成2 200 mg/L U(Ⅵ)儲備液。其他試劑均為市售分析純,所有溶液均采用Milli-Q水制備。

    模擬地下水溶液的配制參照文獻(xiàn)[11],包括礦物元素和微量元素,具體如下:NH4HCO3,5 mg/L;K2HPO4,2 mg/L;MgCl2,2.1 mg/L;Ca(OH)2,1 mg/L;酵母提取物,0.33 mg/L;H3BO3,0.5 μg/L;FeSO4·7H2O,28 μg/L;ZnSO4·7H2O,1.1 μg/L;CuSO4·5H2O,1.6 μg/L;MnSO4·H2O,2.5 μg/L;(NH4)6Mo7O24·4H2O,2.0 μg/L;KAl(SO4)2·12H2O,1.75 μg/L;CoSO4·7H2O,23.6 μg/L;NiSO4·6H2O,1.13 μg/L;Na2SeO3·5H2O,1 μg/L;Na2WO4·2H2O,5.2 μg/L;EDTA,10 μg/L。將模擬地下水溶液壓力滅菌20 min,冷卻至室溫后加入1 g/L NaHCO3溶液,將pH值調(diào)至7.0。U(Ⅵ)在地下水中的絡(luò)合形態(tài)主要是碳酸氫鹽結(jié)合態(tài),因此用NaHCO3溶液作為模擬地下水溶液的緩沖溶液[13],最后充氮?dú)?0 min除去溶解氧。

    NEXION 350電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、Nicolet-5700傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR),美國Perkin Elmer公司;D3024臺式高速微量離心機(jī),美國賽洛捷克。

    1.2 腐敗希瓦氏菌培養(yǎng)

    在無菌條件下將保存的腐敗希瓦氏菌液按2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接到盛有培養(yǎng)基(組成為:胰蛋白胨,15 g;酵母提取物,5 g;氯化鈉,5 g;水,1 L)的錐形瓶內(nèi),再置于恒溫振蕩器中(30 ℃,150 r/min)培養(yǎng)18 h,培養(yǎng)好的菌液以8 000 r/min離心5 min,之后用0.1 mol/L NaCl溶液洗滌2次。

    1.3 腐敗希瓦氏菌對U(Ⅵ)的固定

    所有實(shí)驗均在氮?dú)鈼l件下進(jìn)行。具體步驟如下:1) 向50 mL血清瓶中加入20 mL模擬地下水溶液,再加入0.27 mL U(Ⅵ)儲備溶液,使體系U(Ⅵ)最終濃度為30 mg/L;2) 在上述溶液中依次加入腐敗希瓦氏菌和乳酸鈉,濃度分別為6×108mL-1和10 mmol/L;3) 充高純氮驅(qū)氧,用丁基橡膠塞和鋁密封件密封,溫度控制在(30±1) ℃;4) 在厭氧條件下定期用注射器從血清瓶中抽取0.5 mL菌體樣液進(jìn)行分析。反應(yīng)結(jié)束后,取10 mL混合液進(jìn)行EPS提取分析。每組實(shí)驗均進(jìn)行平行實(shí)驗,并設(shè)置不加腐敗希瓦氏菌的空白對照組。

    1.4 分析方法

    反應(yīng)后腐敗希瓦氏菌體中U(Ⅵ)和U(Ⅳ)的含量根據(jù)文獻(xiàn)[24-25]的方法,采用NaHCO3-HNO3連續(xù)萃取法對腐敗希瓦氏菌中固定的鈾進(jìn)行提取,其原理如圖1所示。在該方法中,NaHCO3萃取的是吸附/絡(luò)合的U(Ⅵ),而HNO3萃取的是不溶性U(Ⅳ)沉淀。在厭氧條件下定期用注射器從血清瓶中抽取0.5 mL菌體溶液,8 000 r/min離心分離5 min后,上清液過0.22 μm濾膜,記為U上清。剩余菌體細(xì)胞用厭氧0.1 mol/L NaCl溶液洗滌2次,去除菌體表面殘留的U(Ⅵ)后,再加入0.5 mL 1 mol/L厭氧NaHCO3溶液提取菌體中的U(Ⅵ),厭氧條件下放置過夜后離心分離,上清液記為UNaHCO3。最后,再加入0.5 mL 10% HNO3提取菌體中的U(Ⅳ),放置4 h后離心分離,上清液記為UHNO3。所有樣品均在5%HNO3中酸化保存,然后用ICP-MS測各組分濃度。

    圖1 腐敗希瓦氏菌中U的NaHCO3-HNO3萃取法提取原理Fig.1 Extraction principle of U from Shewanella putrefaciens by NaHCO3-HNO3 fractionation method

    1.5 EPS提取

    采用陽離子交換樹脂(CER)法、超聲波法和離心法3種方法提取EPS。反應(yīng)后的腐敗希瓦氏菌用0.1 mol/L厭氧NaCl溶液(使用前煮沸并通入氮?dú)怛?qū)氧)清洗2次,去除細(xì)胞表面的可溶性殘留物質(zhì),再用0.1 mol/L厭氧NaCl溶液懸浮至10 mL。所有EPS提取過程均在厭氧條件下進(jìn)行。

    CER法:離子交換樹脂可除去EPS和細(xì)胞之間的二價橋接離子,促使EPS從細(xì)胞表面脫附。取4 mL洗滌后的細(xì)胞懸浮液,按照70 g/g 的可揮發(fā)性懸浮物(VSS)標(biāo)準(zhǔn)稱取CER量,600 r/min攪拌提取1 h,以14 510 r/min離心20 min,上清液過0.22 μm濾膜。

    超聲波法:超聲波法提取EPS的原理是利用超聲波產(chǎn)生的壓力沖擊使EPS和細(xì)胞分離。取4 mL洗滌后的細(xì)胞懸浮液,置于超聲清洗器(150 W)中提取10 min,14 510 r/min離心20 min,上清液過0.22 μm濾膜。

    離心法:離心法提取EPS的原理主要是利用高速離心產(chǎn)生的重力場作用,使EPS和細(xì)胞分離。取2 mL洗滌后的細(xì)胞懸浮液,以14 510 r/min的速度離心20 min,上清液過0.22 μm濾膜。

    1.6 SP-ICP-MS分析EPS中的U

    用單顆粒ICP-MS(SP-ICP-MS)對過0.22 μm濾膜后的EPS提取液中的可溶性U和顆粒U進(jìn)行定量分析,并對顆粒U的粒徑分布進(jìn)行分析。在單顆粒模式下,可溶性鈾酰離子的信號與含鈾粒子的信號明顯不同。因此,EPS中礦物U的含量為總U濃度與可溶性U濃度的差值。為表征納米級鈾粒子的粒徑分布,用已知粒徑和顆粒濃度的納米銀(nanoComposix公司)作為標(biāo)準(zhǔn)粒子。單個膠體粒子進(jìn)入后會在等離子體焰矩內(nèi)被粒子化為離子簇,以瞬時信號的形式被質(zhì)譜檢測到。其中信號強(qiáng)度反映顆粒粒徑,信號頻率反映顆粒濃度。

    1.7 EPS反應(yīng)前后FT-IR分析

    將反應(yīng)前后的EPS冷凍干燥后進(jìn)行FT-IR分析,采用KBr壓片法,掃描波數(shù)為400~4 000 cm-1,掃描次數(shù)為10,分辨率為4 cm-1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 腐敗希瓦氏菌對U(Ⅵ)的固定

    在腐敗希瓦氏菌固定U(Ⅵ)反應(yīng)過程中,對上清液中U的濃度(U上清)進(jìn)行測定,并分析實(shí)驗各階段菌體中的U含量(U菌體=UNaHCO3+UHNO3)和系統(tǒng)的物質(zhì)平衡(U系統(tǒng)=U上清+U菌體),結(jié)果示于圖2。UNaHCO3和UHNO3分別為吸附的U(Ⅵ)(如U(Ⅵ)離子、U(Ⅵ)-碳酸鹽礦物)和還原的U(Ⅳ)的濃度。由圖2可知,未加腐敗希瓦氏菌的空白組的U含量沒有明顯變化,說明U在實(shí)驗體系中沒有發(fā)生沉淀。上清液中U(Ⅵ)濃度隨時間的增加不斷下降,在0~28 h內(nèi)腐敗希瓦氏菌對鈾的去除速度最快,之后逐漸趨于平穩(wěn),最終的去除率為90.9%。由圖2還可看出,系統(tǒng)的U含量(U系統(tǒng))在反應(yīng)過程中沒有明顯變化,表明溶液中的U被腐敗希瓦氏菌固定,系統(tǒng)有很好的物質(zhì)平衡。由于碳酸氫鹽是地下水系統(tǒng)中廣泛存在的無機(jī)配體[26],所以本文著重模擬地下水碳酸氫根的體系。體系的初始pH值設(shè)定為7.0,但實(shí)驗中發(fā)現(xiàn),pH值隨反應(yīng)的進(jìn)行因腐敗希瓦氏菌消耗底物而有所下降,從7.0下降至6.2,處于弱酸性。對于酸度更大的環(huán)境(pH<6),這些材料可能也會適用,后續(xù)會進(jìn)行相關(guān)研究。

    圖2 腐敗希瓦氏菌固定U(Ⅵ)過程中U上清、U菌體和U系統(tǒng)隨時間的變化Fig.2 Usupernatant, Ucells and Usystem in U(Ⅵ) immobilization process by Shewanella putrefaciens

    NaHCO3-HNO3連續(xù)提取反應(yīng)過程中腐敗希瓦氏菌體的U(Ⅳ)和U(Ⅵ)含量的變化示于圖3。由圖3可知,UNaHCO3和UHNO3隨時間的增加而增加,說明腐敗希瓦氏菌至少可通過吸附/絡(luò)合和還原兩種方式固定U(Ⅵ)。菌體中的鈾含量由最初的(0.89±0.09) mg/L增加到(20.70±0.71) mg/L,與上清液中U減少的濃度大體一致,表明溶液中的U(Ⅵ)已被腐敗希瓦氏菌固定。在初始厭氧條件下(t<8 h時),UHNO3較低,這是由于腐敗希瓦氏菌在反應(yīng)初期對缺氧體系的適應(yīng)性調(diào)整,還原率較低,而隨著反應(yīng)的進(jìn)行表現(xiàn)出較好還原效果。UHNO3從最初的(0.11±0.03) mg/L增加到反應(yīng)結(jié)束時的(4.02±0.38) mg/L。以上結(jié)果表明,腐敗希瓦氏菌除吸附作用外還具有還原U(Ⅵ)的能力,可有效將地下水中的U(Ⅵ)還原為U(Ⅳ)。

    圖3 腐敗希瓦氏菌固定U(Ⅵ)過程中UNaHCO3和UHNO3隨時間的變化Fig.3 UNaHCO3 and UHNO3 in U(Ⅵ) immobilization process by Shewanella putrefaciens

    反應(yīng)過程菌體中U(Ⅳ)/U(Ⅵ)比的變化示于圖4。U(Ⅳ)/U(Ⅵ)比隨時間的推移逐漸增加,表明隨著反應(yīng)的進(jìn)行,腐敗希瓦氏菌對U的還原活性逐步被激發(fā)。此外,還說明大多數(shù)U(Ⅵ)在還原成U(Ⅳ)之前先與腐敗希瓦氏菌發(fā)生吸附反應(yīng),U(Ⅵ)與腐敗希瓦氏菌的吸附反應(yīng)較生物還原反應(yīng)快得多。

    圖4 腐敗希瓦氏菌固定U(Ⅵ)過程中U(Ⅳ)/U(Ⅵ)比的變化Fig.4 Variation of ratio of U(Ⅳ)/U(Ⅵ) in U(Ⅵ) immobilization process by Shewanella putrefaciens

    2.2 EPS中的鈾含量

    從腐敗希瓦氏菌中提取的EPS中U的含量在很大程度上取決于提取過程中EPS的提取效率和不溶性U(Ⅳ)的再溶解程度。采用CER法、超聲波法和離心法3種方法提取的EPS中U的含量和UEPS/TUcells比示于圖5。從圖5可看出,離心法和超聲法所得EPS中鈾含量(UEPS)較低,離心法中UEPS為(0.42±0.09) mg/L,超聲法中UEPS為(0.85±0.15) mg/L,這一結(jié)果與EPS提取效率[27]一致,由于其對EPS提取效率較低導(dǎo)致UEPS的含量低。對于CER法,UEPS在很大程度上取決于萃取時間。但隨著萃取時間的延長,不溶性U(Ⅵ)的再溶解也變得嚴(yán)重,在本研究小組之前的研究中,當(dāng)萃取時間為1 h、轉(zhuǎn)速為600 r/min時,U(Ⅵ)再溶解的程度是可接受的[24],CER法中UEPS為(2.91±0.22) mg/L,占腐敗希瓦氏菌固定總鈾量(TUcells=(20.7±0.71) mg/L)的(14.0±1.0)%。對比3種方法,離心法和超聲法的鈾提取效率低,不適用于EPS中鈾的種類和含量的測定,CER法得到的結(jié)果可能更接近EPS中的實(shí)際鈾含量。以上結(jié)果表明,用腐敗希瓦氏菌固定鈾時,EPS具有很強(qiáng)的富集能力,EPS中的鈾含量不可忽略。

    圖5 從腐敗希瓦氏菌中提取的EPS中的鈾含量和UEPS/TUcells比Fig.5 UEPS and UEPS/TUcells ratio of EPS solution extracted from Shewanella putrefaciens

    2.3 EPS中的顆粒鈾

    CER法適合用于表征EPS中的鈾含量及形態(tài)。EPS中可溶性鈾和顆粒鈾的百分比,以及顆粒鈾的粒徑分布列于表1。EPS中可溶性鈾的百分比在初始階段(t=8 h)明顯上升,然后隨著鈾固定反應(yīng)的進(jìn)行逐步下降,說明初始階段EPS中主要發(fā)生鈾酰離子的吸附,然后溶解態(tài)粒子逐步發(fā)生生物還原或生物礦化轉(zhuǎn)化為鈾顆粒。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到44 h時,顆粒鈾占EPS中固定總鈾量的66.6%,表明反應(yīng)結(jié)束時顆粒鈾是EPS中鈾的主要形式。這一結(jié)果與William等[28]的研究結(jié)果一致,ShewanellaoneidensisMR-1的EPS與U(Ⅵ)反應(yīng)形成了約3.0 nm的鈾礦。CER法提取的EPS中顆粒鈾較超聲法和離心法多,進(jìn)一步說明CER法對鈾的萃取效率較高。

    表1 EPS中可溶性鈾和顆粒鈾的百分比及顆粒鈾的粒徑Table 1 Fraction of soluble and particulate U and size of particulate U in EPS

    CER法提取的EPS中鈾顆粒的粒徑分布示于圖6。由圖6可見,鈾粒子隨時間的推移逐漸形成鈾顆粒并增大,顆粒數(shù)從3 144 mL-1增加到87 460 mL-1,平均粒徑從13.5 nm增加到126.9 nm。在腐敗希瓦氏菌固定U(Ⅵ)的初期,EPS中鈾顆粒的數(shù)量減少,平均粒徑增大,但EPS中鈾含量略有增加,表明較小的鈾粒子聚集并長大,在EPS中隨時間積累。需要注意的是,ICP-MS得到的鈾粒子的直徑以鈾原子計,不是含鈾粒子的真實(shí)直徑。然而由于鈾原子遠(yuǎn)大于磷、氧等原子,所以該直徑非常接近實(shí)際粒子的真實(shí)尺寸。

    圖6 CER法提取的EPS中鈾顆粒的粒徑分布Fig.6 Size distribution of nano-sized U particles in EPS extracts by CER method

    上述結(jié)果表明,腐敗希瓦氏菌的EPS在與U(Ⅵ)反應(yīng)后,含有鈾酰離子和鈾礦物,說明EPS固定U(Ⅵ)過程中發(fā)生了生物吸附和生物礦化作用。

    2.4 EPS對U(Ⅵ)的吸附機(jī)理

    圖7 EPS與鈾作用前后的紅外光譜Fig.7 FT-IR spectra of EPS before and after reaction with U(Ⅵ)

    3 結(jié)論

    1) 在處理過含鈾地下水的腐敗希瓦氏菌EPS中發(fā)現(xiàn)大量鈾,占腐敗希瓦氏菌固定鈾總量的(14.0±1.0)%(CER提取法)。

    2) SP-ICP-MS分析表明,EPS結(jié)合的鈾有兩種形態(tài):溶解態(tài)和顆粒態(tài)。除生物吸附外,生物礦化也有助于腐敗希瓦氏菌的EPS固定鈾。

    3) FT-IR分析結(jié)果說明,EPS吸附U(Ⅵ)時主要與EPS中的羧基官能團(tuán)結(jié)合。

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