注射用氨芐西林鈉含量測(cè)定方法的優(yōu)化

王雪靜

(貴州省獸藥飼料監(jiān)察所，貴州 貴陽(yáng) 550003)

注射用氨芐西林鈉屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，是臨床常用的半合成青霉素，性狀為白色或類白色的粉末或結(jié)晶性粉末，適用于敏感菌所致的胃腸道感染、呼吸道感染、尿路感染、軟組織感染、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、敗血癥等?！吨腥A人民共和國(guó)獸藥典》2015年版一部中記載注射用氨芐西林鈉的含量采用的是HPLC法，改進(jìn)方法采用230 nm波長(zhǎng)，進(jìn)樣20μL，流速1.0 mL/min，流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸二氫鉀-甲醇(60∶40)，柱溫30 ℃，并對(duì)方法的準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性、線性和回收率進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器和試藥

儀器設(shè)備：Denver instrument TB-215 D型電子分析天平(美國(guó)丹佛公司)；Agilent 1260 infinity 高效液相色譜儀(配紫外檢測(cè)器)；色譜柱為Waters Symmetry C18色譜柱。對(duì)照品：氨芐西林，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：K0211410，含量86.0 %。試驗(yàn)樣品：注射用氨芐西林鈉，廠家：齊魯動(dòng)物保健品有限公司，規(guī)格：1.0 g批號(hào)：1808010。試劑：甲醇為色譜醇；水為高純水；磷酸二氫鉀為分析純。

1.2 方法

采用高效液相測(cè)定注射用氨芐西林鈉含量的方法，以C18色譜柱，0.05 mol/L磷酸二氫鉀-甲醇(60 ：40)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，測(cè)定波長(zhǎng)230 nm，柱溫30 ℃，從線性、精密度、穩(wěn)定性、添加回收、準(zhǔn)確度五個(gè)方面來進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取對(duì)照品氨芐西林50 mg置于50 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得氨芐西林濃度為1.0 mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液2 mL置于10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得氨芐西林濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的配制：精密稱取樣品50 mg置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度搖勻。另取上述溶液2 mL，置于10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 含量測(cè)定

色譜條件：流動(dòng)相0.05 mol/L磷酸二氫鉀-甲醇(60 ∶40)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；測(cè)定波長(zhǎng)230 nm；柱溫30 ℃。在此色譜條件下，混合對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1、圖2。

圖1 對(duì)照品溶液色譜圖

圖2 供試品溶液色譜圖

2.2 線性范圍

精密取氨芐西林對(duì)照品貯備液適量，加流動(dòng)相稀釋，制得含氨芐西林濃度分別為50、100、200、300、500 μg/mL的對(duì)照品溶液系列。精密吸取各對(duì)照品溶液 20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以氨芐西林色譜峰面積(Area)，對(duì)其相應(yīng)濃度(Amt，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程：Area = 9.5819 ×Amt + 34.367，R2 = 0.9999結(jié)果表明氨芐西林在50～500 μg/mL內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好。

2.3 精密度試驗(yàn)

精密量取氨芐西林濃度0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液20 μL連續(xù)測(cè)定6次，以測(cè)定結(jié)果峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示試驗(yàn)的精密度，氨芐西林色譜峰面積的RSD為0.1 %，表明方法的精密度良好。

2.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取氨芐西林濃度0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液20 μL，分別約于0、2、4 h上機(jī)測(cè)定，每次進(jìn)樣兩針，氨芐西林色譜峰面積平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4 %。結(jié)果表明溶液在4 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5 添加回收試驗(yàn)

精密稱取供試品50 mg，置50 mL量瓶中，得供試品濃度為1.0mg/mL的貯備液，精密量取供試品貯備液和氨芐西林對(duì)照品貯備液各2 mL置于20 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容，做6個(gè)平行。得最終上機(jī)濃度為0.2 mg/mL，測(cè)定計(jì)算回收率，數(shù)據(jù)見表1，結(jié)果表明回收率良好。

表1 氨芐西林回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品準(zhǔn)確度的測(cè)定

取樣品按供試品溶液的制備方法分別制成供試品溶液后進(jìn)行含量測(cè)定，每批樣品作兩個(gè)平行，結(jié)果與藥典方法測(cè)量結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算氨芐西林的相對(duì)偏差(CV)，相對(duì)偏差為0.6 %。

2.7 討論

《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版一部中記載注射用氨芐西林鈉的含量測(cè)定方法，采用HPLC法但流動(dòng)相相當(dāng)復(fù)雜，流動(dòng)相A為12 %醋酸溶液-0.2 moL/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈-水(0.5∶50∶50∶900)；流動(dòng)相B為12 %醋酸溶液-0.2 moL/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈-水(0.5∶50∶400∶550)，流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(85:15)為上機(jī)流動(dòng)相，此法的流動(dòng)相配制復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)結(jié)果色譜圖中出現(xiàn)峰形不對(duì)稱、傾斜的現(xiàn)象。依據(jù)《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版化學(xué)藥品卷中記載的氨芐西林鈉可溶性粉含量測(cè)定的方法，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(50∶50)為流動(dòng)相，由此啟發(fā)得到注射用氨芐西林鈉含量測(cè)定的改進(jìn)方法，采用檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸二氫鉀-甲醇(60 ∶40)，配制簡(jiǎn)單。原方法采用的是254 nm，上機(jī)濃度為1.0mg/mL，進(jìn)樣20μL，峰面積是1000左右，改進(jìn)方法采用的是230nm，上機(jī)濃度為0.2 mg/mL進(jìn)樣20μL，峰面積為1 000左右，氨芐西林在230 nm比254 nm時(shí)吸收更大，上機(jī)濃度低節(jié)約藥品。

3 結(jié)論

注射用氨芐西林鈉含量測(cè)定的HPLC改進(jìn)方法采用230 nm波長(zhǎng)，進(jìn)樣20μL，流速1.0 mL/min，流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸二氫鉀-甲醇(60∶40)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相配制簡(jiǎn)單，峰面積較大，出峰時(shí)間較短，若僅是測(cè)含量，可以采用優(yōu)化后的方法。