崔守瑜,戴奕杰
(1.釣魚臺(tái)賓館管理局,北京 100830;2.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測院,貴州貴陽 550016)
白酒是中國的傳統(tǒng)行業(yè),是世界六大蒸餾酒之一。在不斷發(fā)展過程中,根據(jù)其制作工藝及風(fēng)味的不同,可分為清香、濃香、醬香等基本香型。其中,醬香型白酒以其“醬香突出、優(yōu)雅細(xì)膩、柔綿醇厚、回味悠長”的獨(dú)特風(fēng)味,受到廣大消費(fèi)者的青睞。醬香型白酒的發(fā)酵過程獨(dú)特而復(fù)雜,包括大曲制作、堆積發(fā)酵及窖池輪次發(fā)酵等[1],高溫堆積、高溫蒸餾、多輪次發(fā)酵、生產(chǎn)周期長、貯存時(shí)間長等特點(diǎn)使得醬香型白酒區(qū)別于其他香型酒[2]。醬香型白酒在生產(chǎn)過程中,多階段多輪次的微生物發(fā)酵是質(zhì)控的關(guān)鍵步驟,因此每個(gè)發(fā)酵階段酒醅中的微生物動(dòng)態(tài)變化,對(duì)后期白酒產(chǎn)量及風(fēng)味均具有重大貢獻(xiàn)。尤其堆積發(fā)酵是大曲制作和酒窖發(fā)酵之間的橋梁[3],開放式的地面堆積發(fā)酵能使環(huán)境中的微生物參與到整個(gè)發(fā)酵過程,調(diào)整酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu),以促進(jìn)酒醅中的物質(zhì)充分分解轉(zhuǎn)化,還為美拉德反應(yīng)提供了前提條件。
最近的研究主要集中在酒曲的質(zhì)控提升、窖泥中微生物群落的特征及酒的風(fēng)味成分[4-5],也有研究根據(jù)不同香型酒,分別研究清香型、濃香型、醬香型酒發(fā)酵時(shí)間的不同,比較菌群多樣性與風(fēng)味的相關(guān)性[6-7]。杜艾明[8]調(diào)查了清香型白酒釀造核心功能微生物,主要是乳酸菌、醋酸桿菌、芽孢桿菌、酵母菌及少數(shù)霉菌,這些菌群的更新變化與酒中的風(fēng)味成分具有直接關(guān)系。高江婧[9]研究了濃香型白酒酒醅中風(fēng)味物質(zhì)與微生物群結(jié)構(gòu)隨發(fā)酵時(shí)間的變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)窖池底泥為酒醅提供了梭菌科和瘤胃菌科等厭氧微生物,這些微生物促進(jìn)發(fā)酵后期己酸、丁酸、乙酸的合成,對(duì)濃香型白酒的風(fēng)味具有重大貢獻(xiàn)。高溫堆積發(fā)酵作為醬香型白酒的特征工藝,是大曲釀造和窖池發(fā)酵的緊密連接,在堆積發(fā)酵過程中物料和微生物發(fā)生的變化規(guī)律也是眾多學(xué)者所一直關(guān)注的熱點(diǎn)問題。
本研究以醬香型白酒為研究對(duì)象,研究了在下沙、糙沙輪次堆積發(fā)酵中,酒醅堆積溫度及pH 值與微生物群動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)性,為揭示醬香型白酒生產(chǎn)微生物變化及風(fēng)味形成機(jī)制提供一定的參考。
樣品:下沙、糙沙及7 個(gè)輪次起窖、下窖過程中的酒醅;化學(xué)試劑及培養(yǎng)基均為國藥分析純。
1.2.1 樣品的采集
選取從下沙階段到7 輪次高溫堆積樣品,及酒醅下窖于窖池發(fā)酵的樣品。根據(jù)等距采樣法,分別在酒醅上、中、下層等距采集3 個(gè)位點(diǎn)的樣本。樣本采集后混合均勻,并分裝于無菌袋封裝標(biāo)記,于-80 ℃冰箱中保存。
1.2.2 微生物的分離及計(jì)數(shù)
根據(jù)國標(biāo)GB 4789.2—2016 方法處理樣品。取25 g 不同加工階段的酒醅樣品,于裝有225 mL 無菌生理鹽水(含6 粒玻璃珠)的錐形瓶中,置于搖床中振蕩5 min,使樣品液充分均勻。吸取1 mL樣品液于9 mL 無菌生理鹽水中,混合均勻后,重復(fù)這一步,進(jìn)行梯度稀釋,并吸取100 μL 2~3 個(gè)適宜稀釋梯度的樣品液于不同微生物培養(yǎng)基中,對(duì)霉菌、酵母菌、乳酸菌、芽孢菌及菌落總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
1.2.3 pH值的測定
根據(jù)文獻(xiàn)方法[10],取5 g 酒醅,加入45 mL 蒸餾水,置于漩渦振蕩器上混合均勻。靜置5 min,取上清液測定pH值。
1.2.4 溫度的測定
采用探針溫度計(jì)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期的酒醅堆進(jìn)行溫度測量,待溫度計(jì)數(shù)值穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)。
通過倍比稀釋平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn),酒醅在不同發(fā)酵階段微生物菌群呈動(dòng)態(tài)變化。由表1 可知,發(fā)酵初期(下沙堆積)菌群得以快速增殖,菌落總數(shù)高達(dá)9.7×108CFU/g,主要為酵母菌、乳酸菌,但芽孢桿菌和霉菌仍占一定比例。在糙沙起窖階段,可能是新物料加入,使得原有的微生物菌落數(shù)相對(duì)減少,但隨著堆積發(fā)酵,微生物又利用新的物料進(jìn)行生長代謝,因此各菌群在堆積過程中均有增殖現(xiàn)象。
表1 不同發(fā)酵時(shí)期酒醅中微生物變化 (CFU/g)
窖池發(fā)酵可以再次富集培養(yǎng)環(huán)境中的微生物,在一輪次至三輪次的窖池發(fā)酵中,主要功能優(yōu)勢菌是酵母菌屬,數(shù)量可達(dá)到106~107CFU/g,其次是霉菌屬,數(shù)量在105~107CFU/g。酵母菌是參與發(fā)酵產(chǎn)酒產(chǎn)香的重要微生物,但酵母菌在高溫環(huán)境下無法生存。酵母菌的帶入可能是因?yàn)殚_放式的生產(chǎn)環(huán)境使得環(huán)境中的酵母菌散落在酒醅表面并在堆積發(fā)酵中生長繁殖,之前也有研究證明,酵母菌在酒醅中的豐度是上層高于中、下層[11]。因此在一輪次起窖階段,酵母菌菌落數(shù)遠(yuǎn)低于堆積發(fā)酵時(shí)期。但在下窖期,酵母菌有增殖趨勢,結(jié)合溫度檢測結(jié)果,可能是第一次下窖,窖池溫度較低,適合于酵母菌的大量繁殖。但隨著酒醅在窖池中繼續(xù)發(fā)酵,微生物繁殖釋放出大量熱量,酵母菌無法存活在高溫環(huán)境中,酵母菌在整個(gè)釀造過程中活菌數(shù)呈現(xiàn)出波浪型的變化規(guī)律。
霉菌的主要功能是分泌糖化酶、液化酶及蛋白酶,有助于分解釀酒原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì),有促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)形成的作用[12]。由表1 可知,霉菌在堆積階段是呈上升趨勢的,最大值可達(dá)1.2×107CFU/g,但下窖池發(fā)酵后,可能是因?yàn)楦邷?、水分含量少、缺氧?dǎo)致霉菌最終下降至400 CFU/g。霉菌與酵母菌的變化規(guī)律類似,也是呈動(dòng)態(tài)波動(dòng)的。據(jù)報(bào)道,霉菌能產(chǎn)生豐富的酯化酶系,所產(chǎn)生的酶能將酸與醇縮合成酯,同時(shí),多種霉菌共同發(fā)酵,釋放出含硫香味物質(zhì)的前體,轉(zhuǎn)化為含硫的雜環(huán)香味物質(zhì),形成特有的醬香味[13]。王曉丹[14]從醬香型大曲中分離得到1 株散囊菌——阿姆斯特丹散囊菌,該菌能產(chǎn)生L-芳樟醇、2-庚酮等花果香味,這對(duì)醬香型白酒的風(fēng)味具有一定貢獻(xiàn)。
細(xì)菌是廣泛存在于整個(gè)制作工藝中的,因此通過高溫發(fā)酵后所生存下來的細(xì)菌主要是嗜熱菌,以芽孢桿菌屬、乳酸菌屬為主。在下沙堆積階段,酒醅中乳酸菌含量很高,高達(dá)108數(shù)量級(jí),而在發(fā)酵中期,回落到104數(shù)量級(jí),后期可能窖泥中的厭氧菌摻入酒醅中迅速增殖,而在氧氣充分時(shí),部分死亡,發(fā)酵末期有回升的現(xiàn)象。芽孢桿菌作為高溫大曲中重要功能菌組成成分,在整個(gè)發(fā)酵期間較穩(wěn)定,堆積初期最高可達(dá)5.2×106CFU/g,但在整個(gè)發(fā)酵期基本保持在104CFU/g的豐度,發(fā)酵末期又回升到106CFU/g,符合菌群動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。
圖1 不同發(fā)酵時(shí)期,酒醅溫度的變化
在堆積發(fā)酵過程中,復(fù)雜的微生物群會(huì)分解淀粉、蛋白質(zhì)等釋放出大量熱量,探究堆積發(fā)酵過程的溫度變化有助于間接了解微生物的代謝情況。下沙、糙沙堆積從起堆到堆積完成大概需要3 d,因此我們檢測了堆積24 h、48 h、72 h酒醅溫度變化情況。由圖1 可看出,不管是下沙還是糙沙堆積階段,酒醅溫度均隨發(fā)酵時(shí)間的延長而升高,且在24~48 h 溫度上升很快,在72 h 時(shí)達(dá)到最高,溫度達(dá)41~51.8 ℃。而酒醅在一輪次下窖后,前3 天的溫度變化情況較緩慢,但仍呈上升趨勢。二輪次下窖后的酒醅溫度變化同樣較緩慢,屬于延遲期。在經(jīng)過前期幾輪反復(fù)的起窖發(fā)酵和下窖發(fā)酵后,從三輪次下窖開始,酒醅在酒窖中發(fā)酵溫度上升很快,且溫度高達(dá)60 ℃。各階段的發(fā)酵溫度均與發(fā)酵時(shí)間直接相關(guān),隨發(fā)酵時(shí)間的延長而溫度上升。
綜合以上現(xiàn)象分析,各發(fā)酵階段酒醅變化隨發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)直線型變化,且整體發(fā)酵過程成“V”型曲線,這可能與不同時(shí)期其優(yōu)勢功能微生物菌屬的生長代謝有關(guān)聯(lián),而在后期發(fā)酵更利于嗜熱性微生物生長代謝釋放出大量的熱量。
圖2 不同發(fā)酵時(shí)期,酒醅pH值的變化
由圖2 所知,在發(fā)酵初期,酒醅的pH 值由4.4下降到3.7,這可能是酵母菌的迅速繁殖,產(chǎn)生了大量的CO2,使得酒醅pH 值迅速下降。然而在堆積發(fā)酵中,由于霉菌、酵母菌、乳酸菌及芽孢桿菌均在大量繁殖,代謝產(chǎn)物中和了氫離子的濃度,使得pH值又回調(diào)到了4.4 左右。而在下窖到窖池發(fā)酵階段,酒醅pH 值變化較小,基本穩(wěn)定在3.5 左右,說明pH 3.5 左右時(shí)對(duì)產(chǎn)酸菌的生長有抑制作用,也可能是由于酒醅中的氧氣被消耗掉,進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵,使得酵母從有氧代謝轉(zhuǎn)化為無氧代謝,產(chǎn)生大量酒精。環(huán)境中的厭氧菌和酒醅中的兼性厭氧菌得以增殖,代謝產(chǎn)生有機(jī)酸,大部分有機(jī)酸為弱酸,對(duì)pH值影響不顯著。
通過醬香型白酒酒醅的不同生產(chǎn)加工階段,研究了酒醅中主要的優(yōu)勢微生物菌群及溫度、pH 值的變化,發(fā)現(xiàn)在整個(gè)發(fā)酵生產(chǎn)過程中,菌落總數(shù)呈現(xiàn)出一個(gè)動(dòng)態(tài)的“V”型變化規(guī)律。前期主要以酵母菌屬、乳酸菌屬發(fā)酵產(chǎn)熱產(chǎn)酸,中期芽孢桿菌生長較穩(wěn)定,由于窖池厭氧發(fā)酵,酒醅堆積溶氧量不夠,升溫較緩慢。后期因釀造原料被充分分解,形成了較大的細(xì)孔,且pH 值下降到了3.5 抑制了霉菌及酵母菌的生長,但厭氧性芽孢桿菌得到大量繁殖,釋放出大量熱量。每個(gè)發(fā)酵階段的優(yōu)勢功能菌根據(jù)發(fā)酵環(huán)境及條件的變化進(jìn)行更替,以充分利用釀造原料中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行代謝分解,釋放出各種生物酶,代謝產(chǎn)生具有香味或風(fēng)味的代謝產(chǎn)物,為提升酒產(chǎn)量及酒質(zhì)做出了一定貢獻(xiàn)。