除蟲脲在人工胃/腸液和腸道菌群及生物樣品中的穩(wěn)定性研究

陶 琦，徐玉珍，秦 哲，白莉霞，劉希望，李世宏，楊亞軍，李劍勇

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050)

隨著生活水平的提高，人們對(duì)動(dòng)物性食品的需求量不斷增加。在畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展過程中，人們對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的衛(wèi)生狀況也越來越重視。蠅類的繁殖能力強(qiáng)，分布廣泛，可在養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中大量孳生，不但襲擾動(dòng)物和養(yǎng)殖人員，還可傳播多種疾病，給養(yǎng)殖場(chǎng)的正常生產(chǎn)及生活造成干擾，同時(shí)也是養(yǎng)殖場(chǎng)生物安全的威脅之一。目前，不同規(guī)模的養(yǎng)殖場(chǎng)均存在蠅類孳生的問題，通常采用環(huán)境、生物、物理、化學(xué)等措施進(jìn)行蠅蟲數(shù)量的防控[1-3]。其中，在化學(xué)防控措施中，環(huán)丙氨嗪(cyromazine)已在國(guó)內(nèi)被批準(zhǔn)使用于雞[4-7]；除此之外，在國(guó)外畜牧養(yǎng)殖過程中除蟲脲的使用亦較為廣泛[8]。

口服是最為便捷的給藥途徑之一。但大多數(shù)藥物經(jīng)口服給藥后，會(huì)受到胃腸道中多種因素的影響，如胃液的酸性和腸液的堿性環(huán)境、胃腸道消化酶、腸道上皮細(xì)胞中的酶，以及腸道菌群的影響等，使其在到達(dá)作用部位前發(fā)生降解和代謝。前期研究發(fā)現(xiàn)，除蟲脲在動(dòng)物體內(nèi)代謝較少，絕大部分以原型藥隨糞便排出[16-20]。本研究擬采用高效液相色譜(HPLC)，考察DFB在人工胃/腸液和生物樣品中的穩(wěn)定性，同時(shí)還考察了大鼠腸道菌群對(duì)DFB的降解作用，為后續(xù)的制劑設(shè)計(jì)和開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)：19001，純度>99.8%)；烏拉坦(NJKOCED)；胰蛋白酶(酶活 250NFU/mg，索萊寶，批號(hào)：T8150)；胃蛋白酶(酶活3 000～3 500 NFU/g 索萊寶，批號(hào)：P8390)；磷酸鹽緩沖液(索萊寶，批號(hào)：D1040-500)；厭氧培養(yǎng)基(CM1513 北京陸橋)；泊洛沙姆188(索萊寶，批號(hào)：S7070)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)；鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器

超高效液相色譜儀-紫外檢測(cè)器(DAD)，安捷倫1290；勻漿機(jī)(IKA-T25)；離心機(jī)(Multifuge X3R)；厭氧培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

6只清潔級(jí)SD大鼠，雄性，8～10周，體質(zhì)量210～230 g，購于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：NKMYD201907018。

1.4 溶液配制

1.4.1 儲(chǔ)備液與溶液 稱取除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，以乙腈溶解制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液，于4 ℃儲(chǔ)備。使用前用乙腈稀釋得到相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。

1.4.2 人工胃液的制備 按文獻(xiàn)[21]的方法，取稀鹽酸(取鹽酸234 mL，加水稀釋至1 000 mL)16.4 mL，加水約800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，用3.65 g/L鹽酸溶液調(diào)pH至1.3，然后加水稀釋并定容至1 000 mL，即得人工胃液。空白人工胃液的配制：除不含胃蛋白酶，其余與人工胃液配制相同。

1.4.3 人工腸液的制備 按文獻(xiàn)[21]的方法，取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使其溶解，用4 g/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8；稱取胰蛋白酶10 g，加適量水溶解；將上述兩種溶液混合后，再加水稀釋并定容到1 000 mL，即得人工腸液?？瞻兹斯つc液的配制：除不含胰蛋白酶，其余與人工腸液配制相同。

1.4.4 SD大鼠腸道菌群的制備[22-23]SD大鼠禁食12 h刺激腹部采集新鮮糞便。將糞便與生理鹽水按比例(1 g︰5 mL)渦旋混合制成懸濁液，2 000 g離心10 min(4 ℃)，再將上清液與厭氧培養(yǎng)液按比例(1︰9)混合，置厭氧培養(yǎng)箱中過夜，制得腸道菌群培養(yǎng)液，待用。

1.4.5 空白組織樣品的制備[24-26]取SD大鼠(230～250 g)6只，禁食不禁水過夜，腹腔注射烏拉坦麻醉，迅速處死，取出肝臟、胃、小腸和大腸，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(4 ℃預(yù)冷2 h)沖洗表面后剪碎，再將各組織與磷酸鹽緩沖液按比例(1 g︰5 mL)混合，置于勻漿機(jī)中均質(zhì)后，2 000 g離心10 min(4 ℃)，取上清液，備用。上述操作均在冰浴條件下進(jìn)行。

1.4.6 厭氧培養(yǎng)基的制備 稱取厭氧培養(yǎng)基 9.5 g，加水800 mL搖勻，然后加水稀釋并定容到1 000 mL，高壓滅菌后分裝到試管中，制成厭氧培養(yǎng)基(GAM)，4 ℃保存，備用。

1.5 色譜條件與方法學(xué)考察

1.5.1 色譜條件 參照文獻(xiàn)[27]，略有調(diào)整。Phenomenex luna C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相(A)為6.3 g/L甲酸銨，(B)為乙腈，等度洗脫(A與B的體積比為40︰60)；進(jìn)樣時(shí)間15 min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.5.2 方法學(xué)考察 方法專屬性：分別取空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液、人工腸液、人工胃液+DFB儲(chǔ)備液、人工腸液+ DFB儲(chǔ)備液、空白人工胃液+ DFB儲(chǔ)備液、空白腸道菌液、空白肝液、空白胃液、空白大腸及其內(nèi)容物、空白小腸及其內(nèi)容物。按照“1.5”項(xiàng)下的樣品處理方法操作后，按“1.5.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，對(duì)比色譜圖。觀察BFD標(biāo)準(zhǔn)品的出峰位置是否有其他物質(zhì)干擾。

精密度試驗(yàn)：精密吸取DFB儲(chǔ)備液10、40、100 μg/mL各1份，在不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、4 h、8 h、12 h、24 h)按照 “1.5.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：精密吸取DFB儲(chǔ)備液10、40、100 μg/mL各6份，再按“1.5.1”項(xiàng)下進(jìn)樣1次，記錄峰面積。

1.6 樣品處理

1.6.1 人工胃/腸液樣品處理 移取DFB儲(chǔ)備液4份(1 mg/mL)，每份500 μL，分別置于 50 mL容量瓶中，由于DFB的水溶性差，在人工胃、腸液加入一定量的增溶劑泊洛沙姆188，以增加DFB在樣品中的溶解性，然后分別用處理過的空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液、人工腸液稀釋并定容，充分混勻后，再分裝EP管中(每管 1 mL，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行3份)，于37 ℃水浴中孵育不同時(shí)間后分別取樣300 μL，加入冰乙腈700 μL以終止反應(yīng)，渦旋混勻，于4 ℃下14 000 g離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，按 “1.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。

1.6.2 SD大鼠腸道菌群處理 在前述過夜培養(yǎng)液加入一定量的增溶劑泊洛沙姆188，以增加DFB的溶解性，移取1 mL培養(yǎng)液于EP管中，分別加入DFB儲(chǔ)備液10 μL，渦旋混勻后置入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，培養(yǎng)不同時(shí)間后分別取樣0.5 mL于EP管中(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行3份)，加入冰乙腈(-20 ℃預(yù)冷2 h)1 mL以終止反應(yīng)，12 000 g離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，按“1.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。以培養(yǎng)相同時(shí)長(zhǎng)不含DFB的培養(yǎng)液為空白對(duì)照，同法 操作。

1.6.3 空白組織樣品處理 在上清液中加入一定量的增溶劑泊洛沙姆188來增加DFB在樣品中的溶解性。將上述制備好的上清液迅速分裝到EP管中(每管1 mL，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行3份)，加入DFB儲(chǔ)備液10 μL，混勻后置37 ℃水浴中孵育不同時(shí)間后，移取300 μL，加入700 μL冰乙腈以終止反應(yīng)，渦旋2 min，14 000 g離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，按“1.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法專屬性

如圖1所示，在該色譜條件下，DFB能被檢出，保留時(shí)間為5.30 min，分離度良好，不受其他物質(zhì)干擾。表明樣品測(cè)定條件以及處理方法具有專屬性，不受基質(zhì)干擾。

2.2 精密度試驗(yàn)

DFB低、中、高3種質(zhì)量濃度在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得峰面積如表1所示。RSD 值為分別為 0.1%、0.12%、0.18%，表明儀器精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

不同樣品測(cè)得峰面積見表2。RSD值分別為0.1%、0.12%、0.18%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

表2 方法重現(xiàn)性結(jié)果

2.4 DFB在人工胃/腸液中的穩(wěn)定性

以0 h時(shí)DFB的峰面積為100%，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的剩余百分比，結(jié)果見圖2。如圖所示，經(jīng)過6 h、37 ℃孵育后，在空白胃液、人工胃液及空白腸液、人工腸液中的相對(duì)剩余百分率分別為(93.23±1.55)%、(92.46±2.33)%、(82.97± 1.13)%、(77.41±0.74)%。結(jié)果說明，在堿性或胰蛋白酶存在的條件下，DFB相對(duì)于在酸性或胃蛋白酶存在的環(huán)境中更易被降解；DFB在堿性或胰蛋白酶的條件下穩(wěn)定性較差(約下降20%)，而不易受酸性及胃蛋白酶的影響。

2.5 DFB在SD大鼠腸道菌群中的穩(wěn)定性

以0 h時(shí)DFB的峰面積為100%，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的剩余百分比，結(jié)果見圖3。如圖所示，經(jīng)過12 h、37 ℃ 孵育后，DFB在SD大鼠腸道菌群中孵育時(shí)發(fā)生了相對(duì)降解，但相對(duì)剩余百分率在90%上，總體表現(xiàn)出穩(wěn)定的趨勢(shì)。結(jié)果表明，DFB不易受SD大鼠腸道菌群的影響。

2.6 DFB在生物樣品中的穩(wěn)定性

以0 h時(shí)DFB的峰面積為100%，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的剩余百分比，結(jié)果見圖4。如圖所示，經(jīng)過6 h、37 ℃孵育后，在胃液、肝液、大腸及其內(nèi)容物、小腸及其內(nèi)容物的相對(duì)剩余百分率分別為(93.05±0.84)%、(95.38±0.7)%、(94.58± 0.424)%、(84.06±0.212)%。結(jié)果表明，DFB在胃液、肝液、大腸及其內(nèi)容物中基本穩(wěn)定，但在小腸及其內(nèi)容物中有一定的降解(約16%)。

3 討 論

口服藥物在胃腸道環(huán)境下的穩(wěn)定性考察，是新藥開發(fā)的重要研究?jī)?nèi)容，而藥物在胃腸道中的含量變化是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)采用液相色譜法，考察了DFB在人工胃/腸液、腸道菌群及生物樣品中的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DFB在空白胃液和人工胃液中有一定降解，但DFB的剩余百分比均在90%以上，總體表現(xiàn)出穩(wěn)定趨勢(shì)。DFB在空白腸液和人工腸液中發(fā)生降解(約20%)，表明在堿性或胰蛋白酶存在的條件下，DFB相對(duì)于在酸性或胃蛋白酶存在的環(huán)境中更易降解。此結(jié)果與前期的研究結(jié)果相似，左三齡等[27]研究發(fā)現(xiàn)，DFB在酸性介質(zhì)中穩(wěn)定性較堿性條件下更為穩(wěn)定。

鑒于進(jìn)入腸道的藥物會(huì)受到腸道菌群的影響，本研究另外測(cè)定DFB在SD大鼠腸道菌群中的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，DFB在SD大鼠腸道菌群中表現(xiàn)出穩(wěn)定的趨勢(shì)，說明腸道菌群對(duì)DFB幾乎沒有代謝作用。為了使試驗(yàn)條件更加接近生物體內(nèi)代謝環(huán)境，本研究檢測(cè)了DFB在生物樣品中的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)DFB在大鼠肝臟、大鼠胃液、大鼠大腸及內(nèi)容物中都表現(xiàn)出穩(wěn)定的趨勢(shì)，而在大鼠小腸及內(nèi)容物中有降解(約16%)，這與上述DFB在空白腸液和人工腸液中的結(jié)果較為一致。

綜上所述，DFB在堿性及胰蛋白酶存在的條件下有一定的降解，表明DFB在動(dòng)物體內(nèi)的代謝主要發(fā)生在小腸。

該研究結(jié)果表明，DFB在開發(fā)口服制劑時(shí)需要進(jìn)行特殊的處理來防止DFB在體內(nèi)的降解，同時(shí)也為DFB的后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。