甜玉米芯多糖對α-淀粉酶抑制作用研究

王 鑫，王峙力，謝靜南，韓 燁，張 凱，馬永強,

（1.黑龍江省谷物食品與谷物資源綜合加工重點實驗室，哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150076；2.黑龍江省林業(yè)科學研究院，黑龍江哈爾濱 150081；3.哈爾濱工業(yè)大學生命科學與技術學院，黑龍江哈爾濱 150080）

甜玉米芯是甜玉米（Zea maysL.）一種常見的副產(chǎn)物，含有豐富的纖維素，是一種可回收利用的生物資源[1]。但由于利用程度較低，大多數(shù)被廢棄焚燒處理，造成資源浪費[2]。甜玉米芯多糖（Sweet corncob polysaccharide，SCP）是甜玉米芯中的一種具有多種生物活性的重要物質(zhì)，其被證明具有降低血糖、改善造血功能等作用，具有一定的研究價值[2]。目前環(huán)境保護及推動農(nóng)業(yè)健康發(fā)展是廣受關注的議題[3]，因此探討如何有效利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物具有一定研究價值。

如今，糖尿病普遍存在于中老年人群，威脅著人們的健康，中國糖尿病患病數(shù)量每年都在增加[4]?，F(xiàn)階段對于糖尿病的治療方法中，減少小腸對葡萄糖吸收、控制餐后血糖水平是有效的途徑[5]。α-淀粉酶在消化途徑中發(fā)揮重要作用，可將食物中的碳水化合物轉(zhuǎn)化為葡萄糖，經(jīng)小腸進入血液而升高血糖，一些已投入使用的抗糖藥物，如阿卡波糖、米格列醇等，通過抑制α-淀粉酶等腸酶的活性，來控制糖尿病患者飯后的血糖含量[6]。

糖尿病、高血脂、高血糖等疾病都可以使用α-淀粉酶抑制劑來治療[7]，現(xiàn)階段的糖尿病患者大多數(shù)長期依賴于胰島素或口服藥物來維持血糖水平[8]，所以尋找無副作用的天然降糖藥物就是目前研究的重要方向[9]。多糖是一種大分子碳水化合物，具有α-淀粉酶抑制效果的多糖類物質(zhì)有很多種，如石莼多糖[10]等，但關于甜玉米芯多糖對α-淀粉酶活性的影響尚未受到關注。

目前關于多糖對α-淀粉酶抑制作用的研究主要集中于抑制類型和競爭方式的研究，而對鼠源小腸酶體外實驗的研究相對較少。本研究針對甜玉米芯多糖組分SCP50對α-淀粉酶的抑制作用及抑制類型進行探討，并在此基礎上，評價其對大鼠腸源α-淀粉酶活性的影響，以全面探討SCP50對腸內(nèi)碳水化合物消化吸收的影響，及其應用于抗糖尿病保健食品、藥品領域的潛力，為之后的動物實驗和尋找α-淀粉酶體內(nèi)抑制作用機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性Wista大鼠 體質(zhì)量為（200±5）g，在長春億斯實驗動物中心購買，生產(chǎn)許可編號：Scxk（Ji）-2011-0004，合格證編號：201500010264，動物飼料由長春億斯實驗動物中心提供；所有實驗均按照實驗動物的保護和使用指南進行，并經(jīng)黑龍江省疾病控制和預防中心的動物護理委員會批準。甜玉米芯 昊偉農(nóng)業(yè)有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）美國Sigma公司；可溶性淀粉 上海和氏璧化工有限公司；α-淀粉酶 美國Sigma-Aldrich公司；疊氮化鈉、氯化鈉 天津致遠化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 天津科密歐化學試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸 純度＞98，國藥集團化學試劑有限公司；KI 天津市光復科技發(fā)展責任有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

FW177型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；EMS-9A型加熱磁力攪拌器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；EV241型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 北京萊伯泰科儀器股份有限公司；UV 5500PC型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；ALC-1100.2型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；SMP6型酶標儀 SoftMax Pro 6 Software。

1.2 實驗方法

1.2.1 甜玉米芯粗多糖的提取工藝流程 甜玉米芯→干燥粉碎→過篩→脫脂→浸提→離心取上清液→脫蛋白→濃縮→脫色→醇沉（體積分數(shù)50%酒精）→DEAE 52纖維素柱層析→葡聚糖凝膠G-100柱層析純化→冷凍干燥→SCP50

將甜玉米芯去除雜質(zhì)后干燥粉碎過80目篩，得到甜玉米芯粉，加入正己烷試劑，按照質(zhì)量體積比為3:25 g/mL對其進行脫脂，離心棄上清液，然后稱取殘渣熱水浸提：按料水比1:20 g/mL加水，100 ℃提取3 h，4000 r/min離心10 min后收集上清液，對其脫蛋白（Sevage法）、脫色[11]（D301R大孔弱堿性陰樹脂法）后加入50%的乙醇醇沉12 h，除去上清液并冷凍干燥得到的醇沉物，得甜玉米芯多糖粉末SCP[11]備用。

1.2.2 甜玉米芯多糖組分分離純化 稱取1.00 g SCP溶解于5.00 mL蒸餾水中，使用纖維素柱層析DEAE-52分離[12]、葡聚糖凝膠柱層析Sephadex-G100純化[13]，全部以蒸餾水為洗脫劑，流速為1 mL/min，5.00 mL/管收集，通過苯酚-硫酸法[14]隔管跟蹤檢測多糖含量，分別以洗脫液管數(shù)和吸光度值為橫縱坐標繪制多糖洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線，將有效峰值的管進行合并收集，濃縮、凍干后得到甜玉米芯多糖SCP50。

1.2.3 SCP50對α-淀粉酶活性抑制作用 根據(jù)邵元元、董麗娟[15-16]的方法并稍作修改，如表1所示，將SCP50配制濃度分別為2、4、6、8、10 mg/mL，取0.3 mL的α-淀粉酶溶液與SCP50均勻混合37 ℃水浴預熱5 min，同時加入己預溫的1%淀粉溶液（PBS配制）0.3 mL，在37 ℃水浴下反應一定時間，立即加入0.5 mL DNS溶液顯色，在沸水中水浴5 min，冷卻后經(jīng)蒸餾水稀釋至10 mL，在540 nm處測定吸光值（A3）。用阿卡波糖（2、4、6、8、10 mg/mL）做陽性對照組，蒸餾水替代抑制劑及磷酸鹽緩沖溶液（67 mmol/L pH 6.8）替代α-淀粉酶（A2）做空白對照物；磷酸鹽緩沖溶液替代α-淀粉酶（A4）做背景對照組；以蒸餾水替代抑制劑（A1）做空白組。抑制率的計算見式（1）。做三次平行實驗，根據(jù)抑制率算得IC50。

表1 α-淀粉酶活性抑制體系Table 1 Inhibition system of α-amylase activity

1.2.4 SCP50對α-淀粉酶活性抑制動力學研究

1.2.4.1 確定α-淀粉酶最適酶濃度和作用時間 使用Bernfeld法測定[17]，用磷酸鹽緩沖液（67 mmol/L pH 6.8）配制1%的淀粉底物，以2 mL 67 mmol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液做空白，取不同濃度的α-淀粉酶溶液（0.4、0.8、1.2、1.6、2 U/mL）作對照。在37 ℃下預熱0.3 mL的α-淀粉酶5 min，加入預溫后的1%淀粉溶液0.3 mL，在酶促反應開始后，準確計時，每過1 min添加0.5 mL DNS終止劑終止反應，沸水浴5 min后，冷卻稀釋定容至10 mL，在540 nm下測定吸光光度值，共計10 min。空白對照以0.3 mL磷酸鹽緩沖溶液代替酶液，通過作圖篩選出α-淀粉酶的最適酶量以及反應時間。

1.2.4.2 SCP50對α-淀粉酶抑制類型研究 按照上述1.2.3中實驗方法進行操作，在空白管中使用0.3 mL緩沖液代替α-淀粉酶液，分別于540 nm處測定0、1 mg/mL濃度的甜玉米芯多糖SCP50時的吸光值，三組平行實驗。將酶濃度與反應速率作為橫縱坐標作圖，根據(jù)反應速率直線是否過原點，確定SCP50對α-淀粉酶的抑制類型[16]。

1.2.4.3 SCP50對α-淀粉酶競爭方式研究 分別配制1、0.05%、0.025%、0.0125%、0.00625%淀粉溶液，按照1.2.3的試驗方法進行操作，分別在540 nm下測定有無甜玉米芯多糖SCP50時吸光值，三組平行實驗。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，X軸為底物濃度的倒數(shù)，Y軸為酶促反應速度的倒數(shù)，繪出SCP50對α-淀粉酶的抑制曲線并明確其競爭方式，按式（2）～（4）計算。

式中：Ki—抑制常數(shù)；Km—米氏常數(shù)；v—反應速度；[I]—抑制劑濃度；[S]—底物濃度；α—表觀系數(shù)。

1.2.5 SCP50對大鼠腸源α-淀粉酶的抑制作用

1.2.5.1 大鼠小腸酶液的提取和活力測定 將一只正常大鼠麻醉猝死，立即取出小腸，流水洗凈內(nèi)容物后，加入4 ℃預冷后的PBS溶液，質(zhì)量體積比為1:3，勻漿后，4000 r/min離心20 min，收集上清液分裝備用[18]，貯存于-20 ℃。根據(jù)α-淀粉酶水解淀粉為還原糖，參照DNS（3，5-二硝基水楊酸）比色法[19]，取0.3 mL小腸酶液37 ℃預熱5 min，加入己預溫的淀粉溶液0.3 mL在37 ℃下反應一定的時間，加入0.5 mL DNS溶液終止反應，沸水浴5 min后，取出冷卻，蒸餾水稀釋定容至10 mL，以蒸餾水代替小腸酶液作為空白，540 nm下測定吸光值，按式（5）～（6）計算。將在37 ℃，pH 6.8條件下，1 L溶液中1 min生成1 μmol葡萄糖定義為1個酶活力單位。

式中：C—葡萄糖濃度，mmol/L；5.55—校準濃度。

1.2.5.2 SCP50對α-淀粉酶的抑制作用鑒別試驗根據(jù)尚禹東[18]參考文獻中的實驗方法略作修改，如表2所示，取上述小腸酶液0.35 mL，放入37 ℃的Krebs-Henseleit緩沖液中，陰性對照組，加入2.5 mL、Krebs- Henseleit緩沖液配制的2%淀粉溶液以及2.5 mL的 Krebs- Henseleit緩沖液，不加小腸酶液及降糖藥物，其他各組同時加入小腸酶液和2.5 mL的Krebs- Henseleit緩沖液配制的2%淀粉液，分別在實驗對照組中加入2.5 mL甜玉米芯多糖SCP50樣品高（10 g/L）、中（5 g/L）、低（2.5 g/L）；用相同體積的阿卡波糖（5 g/L）替代SCP50溶液作為陽性對照組；用同體積Krebs- Henseleit緩沖液代替甜玉米芯多糖SCP50溶液作為正常對照組，每組3管平行進行測定。

37 ℃下水浴振蕩1 h后取混懸液0.5 mL，加入0.1 mL、0.02 mol/L I2-KI溶液，淀粉在I2-KI存在的條件下會呈現(xiàn)特征性的藍色，620 nm下測其吸光度值，加入2.5 mL 2%淀粉溶液和0.1 mL、0.02 mol/LI2-KI溶液作為空白，計算反應液中SCP50對α-淀粉酶的抑制率，如公式（7）。通過正常對照組和陰性對照組A值的對比，確定在無任何SCP50的干預情況下，反應前和反應后淀粉的水解程度。在加入SCP50后，分別通過與正常對照組和陰性對照組的比較，判斷甜玉米芯多糖SCP50對其活性的抑制效果。

表2 分組及給藥Table 2 Grouping and administration

1.2.5.3 SCP50及陽性藥物抑制作用的量效曲線 用0.1 mol/L、pH 6.8的PBS溶液配制成20.0000、10.0000、5.0000、2.5000、1.2500、0.6250及0.3125 g/L共7個濃度梯度SCP50溶液；用PBS配制1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、g/L 7個濃度梯度阿卡波糖溶液，各5 mL。在藥物濃度對數(shù)值及抑制率的橫縱坐標軸中求出直線方程并計算IC50。

繪制陽性藥對α-淀粉酶的抑制曲線以及測定IC50：如表3所示，向48孔板中加入0.3 mL、0.5%淀粉溶液（PBS配制），0.4 mL的PBS溶液，在除陰性組外，加入0.3 mL小腸酶液在正常對照組和不同濃度的陽性藥物組中；陰性組用等體積的PBS代替。每個濃度三孔平行進行實驗，在37 ℃下反應20 min，冰水浴冷卻10 min，再加0.2 mL濃度為0.4 mmol/L的I2-KI溶液顯色，620 nm下測吸光度值，3管平行測定[20]。

表3 分組及添加量Table 3 Grouping and addition

繪制SCP50對α-淀粉酶的抑制曲線以及測定IC50：按上述實驗方法操作，使用SCP50替代陽性藥，計算反應液中SCP50對α-淀粉酶的抑制率，繪制抑制曲線并計算出IC50的數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用DPS軟件進行處理。所有數(shù)據(jù)均用平均值±標準偏差表示，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計分析，采用 Origin 8.5完成圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜玉米芯多糖分離純化

2.1.1 甜玉米芯多糖DEAE-52柱層析純化 如圖1，甜玉米芯多糖經(jīng)過以蒸餾水為洗脫劑的DEAE-52的柱層析后，得到了一個峰型顯著的主峰，還有若干個峰型較小，不利于收集，所以收集經(jīng)過蒸餾水洗脫后的多糖，僅得到一種非極性多糖，即中性糖。根據(jù)上述分析，甜玉米芯多糖經(jīng)過以蒸餾水為洗脫劑的DEAE-52的柱層析后合并主峰第20管至34管可以得到均一組分的甜玉米芯多糖，備用。

圖1 甜玉米芯多糖DEAE-52色譜柱蒸餾水洗脫曲線Fig.1 DEAE-52 distilled water column elution curve of sweet corncob polysaccharides

2.1.2 甜玉米芯多糖葡聚糖凝膠G-100凝膠柱層析純化 根據(jù)圖2可知，在第28管至第38管范圍內(nèi)出現(xiàn)了一個峰型顯著且較為對稱的峰，甜玉米芯多糖組分經(jīng)過以蒸餾水為洗脫劑的DEAE-52過柱后，再經(jīng)過G-100凝膠柱層析后，可得到均一的中性糖。合并第28管至第38管中的甜玉米芯多糖組分，備用，命名為SCP50。

圖2 SCP50組分Sephadex G-100凝膠柱洗脫曲線Fig.2 Elution curvesof SCP50 by Sephadex G-100 gel column

2.2 SCP50對α-淀粉酶活性抑制分析

如圖3所示，當SCP50的濃度為2 mg/mL時，SCP 50的抑制率達到了26.67%±1.67%，當濃度增大到10 mg/mL時，抑制率達到了75.44%±1.94%。其IC50為5.129±0.34 mg/mL。雖然甜玉米芯多糖SCP50與陽性藥阿卡波糖的抑制率相比有一定差距，但SCP50對α-淀粉酶還是具有一定的抑制效果。黃紹華[21]等報道的山藥多糖和曾傲瓊[22]等人報道的條斑紫菜多糖與本實驗結(jié)果相似，均對α-淀粉酶產(chǎn)生劑量依賴的抑制作用。

2.3 甜玉米芯多糖SCP50對α-淀粉酶活性抑制動力學

圖3 SCP50對α-淀粉酶活性的抑制曲線Fig.3 The activity inhibition curve of SCP50 on α-amylase

圖4 不同濃度α-淀粉酶反應動力學進程曲線Fig.4 Reaction kinetics curves in different concentrations of α-amylase

2.3.1α-淀粉酶最適酶濃度和反應時間的分析 如圖4所示，不同濃度α-淀粉酶在10 min內(nèi)反應速率與酶濃度之間存在線性關系，確定適合的酶量是研究動力學的關鍵步驟[23]。從圖中可以明顯看出，反應6 min之前線性關系較良好，酶濃度為0.4、0.8、1.2 U/mL三條動力學的線性關系良好，綜上試驗數(shù)據(jù)可看出，為保證反應進程中按照初始速度進行，選擇最適酶量為1.2 U，反應時間為5 min為宜[24]。這與楊小倩[25]等報道玉蜀黍不同部位提取物對α-淀粉酶抑制作用得到的最佳反應時間為10 min不同，可能是由于二者的抑制劑不一樣導致結(jié)果不一樣，具體的原因需要更深層的探究。

2.3.2 甜玉米芯多糖對α-淀粉酶抑制類型 由圖5可知，在反應過程中沒有甜玉米芯多糖SCP50的存在時，反應速率是一條經(jīng)過原點的直線[23]，在原反應體系中加入酶抑制劑甜玉米芯多糖后，反應速度隨著酶量多少及加入抑制劑后的變化由圖可知，加入甜玉米芯多糖SCP50后得到的反應速率直線通過原點，且斜率低于無抑制劑的曲線。由此可以得出甜玉米芯多糖SCP50對α-淀粉酶抑制類型屬于可逆抑制類型[15]。這是由于SCP50與底物共同競爭同一位置，使得SCP50與α-淀粉酶結(jié)合，且α-淀粉酶不再與底物結(jié)合，從而降低反應速度，且產(chǎn)物形成可逆。

圖5 SCP50對α-淀粉酶抑制作用類型Fig.5 The inhibition type of SCP50 on α-amylase

2.3.3 甜玉米芯多糖SCP50對α-淀粉酶競爭方式根據(jù)Lineweaver-Burk方法繪制雙倒數(shù)曲線[26]，由圖6可知，三條直線在允許誤差范圍內(nèi)均交于Y軸，通過y2mg/mL=4.66x2mg/mL+6.958可以得出，α-淀粉酶的Km值為0.669，Vmax為0.1437 mol/L·min-1。隨著加入SCP50質(zhì)量濃度的增加，雙倒數(shù)直線與橫坐標的截距變小，與縱坐標的截距不變，可知Km2mg/mL＞Km1mg/mL，且Vmax不變，甜玉米芯多糖與底物結(jié)構相似，酶的活性中心由二者共同競爭，故SCP50是一種競爭可逆性的α-淀粉酶抑制劑。這與高粱原花青素[27]和山藥多糖[21]對α-淀粉酶活性的競爭方式相似，與甜葉菊毛狀根綠原酸類化合物[28]及黑果腺肋花楸多酚[29]對α-淀粉酶活性的競爭方式不同，底物和抑制劑與酶的結(jié)合既無互相排斥，也無互相促進，即底物、抑制可同時獨立地與酶結(jié)合，屬于非競爭性抑制。

圖6 不同SCP50濃度下反應的1/[S]和1/[V]雙倒數(shù)曲線Fig.6 The 1/[S] and 1/V double bottom graph under different concentration of SCP50 reaction

2.4 SCP50對α-淀粉酶的抑制作用

2.4.1 SCP50對大鼠小腸內(nèi)α-淀粉酶抑制作用測定的結(jié)果 通過實驗測得大鼠小腸酶活力值為71.3±1.32酶活單位；由圖7可知，陽性藥對其抑制率為49.54%±1.93%，且抑制效果較SCP50各劑量組效果明顯，其中甜玉米芯多糖SCP50高、中劑量組抑制率與陽性藥組抑制率相比顯著降低（P＜0.05），抑制率為24.65%±1.34%和15.21%±1.43%，SCP50低劑量組與陽性藥組相比高度顯著降低（P＜0.001），抑制率為11.23%±0.56%，且呈現(xiàn)明顯的量效關系。

2.4.2 SCP50及陽性藥物抑制作用的量效曲線

2.4.2.1 陽性藥（阿卡波糖）對小腸內(nèi)α-淀粉酶的抑制曲線 圖8為陽性藥對α-淀粉酶的抑制曲線，淀粉酶的抑制率方程為：y=4.318x+26.625，R2=0.9905，IC50為5.413 mg/mL。通過對于測定結(jié)果的分析，阿卡波糖濃度越高劑量越大對小腸α-淀粉酶抑制作用也就越強。

圖7 正常大鼠小腸內(nèi)α-淀粉酶抑制測定Fig.7 Determination of α-amylase inhibition in small intestine of normal rats

圖8 不同濃度陽性藥對α-淀粉酶的抑制率Fig.8 Inhibition rate of α-amylase under different concentration of positive medicine

2.4.2.2 SCP50對小腸內(nèi)α-淀粉酶抑制曲線 由圖9可知SCP50對α-淀粉酶的抑制率方程：y=1.5697x+7.059，R2=0.9949，IC50為27.263 mg/mL。通過測定結(jié)果，得出SCP50對小腸α-淀粉酶具有劑量依賴的抑制作用，因而能夠減少餐后血糖的上升，使血糖吸收平緩，降低空腹血糖。李蘭等[30]報道綠茶提取物的降血糖研究，溫正輝等[31]報道蒲桃不同部位對α-淀粉酶抑制作用與本實驗結(jié)果相似。

圖9 不同濃度SCP50對α-淀粉酶的抑制率Fig.9 Inhibition rate of α-amylase under different concentration of SCP50

3 結(jié)論

活性物質(zhì)對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用的檢測經(jīng)常使用動物源腸酶。甜玉米芯是一種常見的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物，實驗探究其中分離純化的多糖組分SCP50對α-淀粉酶的抑制效果、抑制類型，并進一步探究了甜玉米芯多糖SCP50對鼠源α-淀粉酶的抑制作用。

實驗結(jié)果表明：甜玉米芯多糖組分SCP50對α-淀粉酶是一種可逆性競爭性抑制，抑制作用明顯，可快速降低α-淀粉酶酶促反應速度，Km值為0.669，Vmax為0.1437 mol/L·min-1；在鼠源腸酶抑制試驗中，SCP50可以抑制正常大鼠離體小腸內(nèi)的α-淀粉酶，IC50為27.263 mg/mL，結(jié)果呈劑量依賴。結(jié)果提示甜玉米芯多糖組分SCP50具有潛在的抗糖尿病作用，研究為農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的高值利用提供可能途徑。