活血化瘀解毒方對重癥胰腺炎合并急性腎損傷大鼠相關(guān)炎癥因子、Bax及Bcl-2表達(dá)的影響?

董玉崗 汪 妍 韓 燕

（1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九七〇醫(yī)院，山東 威海 264200；2.山東省威海市立醫(yī)院，山東 威海 264200）

重癥胰腺炎是臨床上常見的急腹癥，具有病死率高、并發(fā)癥多以及預(yù)后差等特點。急性腎損傷是重癥胰腺炎最主要的并發(fā)癥之一，亦是患者延長住院時間、增加死亡率的主要原因［1］。炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子在重癥胰腺炎并發(fā)腎損害的病理生理學(xué)發(fā)病機制中起著重要的作用。目前針對重癥胰腺炎合并急性腎損傷尚無特效療法。隨著對重癥胰腺炎病理及病機的深入研究，中醫(yī)藥在其治療方面的療效逐漸得到循證醫(yī)學(xué)的認(rèn)可［2］?；钛鼋舛痉绞侵袊嗣窠夥跑娐?lián)勤保障部隊第九七〇醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定處方，具有活血化瘀，解毒瀉下的功效，在本院應(yīng)用多年。本研究通過建立重癥胰腺炎合并急性腎損傷大鼠模型，探討活血化瘀解毒方對重癥胰腺炎合并急性腎損傷大鼠細(xì)胞炎癥因子、凋亡基因（Bax）及抑制凋亡基因（Bcl-2）表達(dá)的影響，旨在為活血化瘀解毒方治療急性胰腺炎合并急性腎損傷提供更充分的實驗及理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 75只SPF級SD大鼠，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供［SCXK（京）2018-0019］，雌雄各半，體質(zhì)量（250±20）g。每籠5只，自由飲水進(jìn)食，在室溫（23±2）℃下，通風(fēng)良好。

1.2 試藥與儀器 1）藥物：活血化瘀解毒方（組成：生大黃30 g，板藍(lán)根、白花蛇舌草、水牛角各20 g，赤芍、丹參各15 g，川芎、瓜蔞、甘草各10 g，均為中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九七〇醫(yī)院中藥房提供，藥材加水浸泡30 min，加8倍量水煎煮2次，濾過，分別濃縮成0.25、1 g/mL的煎煮液，放涼后待用），川芎嗪注射液（國藥集團(tuán)容生制藥有限公司）。2）試劑：水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），隱血試劑盒、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒由北京索萊寶科技有限公司提供，C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）ELISA試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司，兔抗大鼠Bax多克隆抗體和Bcl-2多克隆抗體均由Santa Cruz公司提供。L-精氨酸和牛磺膽酸鈉（美國Sigma公司提供）。3）儀器：儀器：Hll/YF-9光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司產(chǎn)品）；JIDI-20D臺式多用途高速離心機（廣州吉迪儀器有限公司）；自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司產(chǎn)品）；7600全自動生化分析儀（日本日立公司產(chǎn)品）。

1.3 分組及造模 1）分組：SPF級雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，進(jìn)行敞箱實驗。將評分相近的75只SD大鼠隨機分為5組，每組15只，即假手術(shù)組、模型組、陽性組、高劑量實驗組和低劑量實驗組。2）動物模型制備：參考文獻(xiàn)［3］制作重癥胰腺炎合并急性腎損傷大鼠模型。將模型組及用藥組大鼠水合氯醛麻醉，俯臥固定于手術(shù)臺，采用血管夾夾閉膽管，24號套管針自十二指腸前壁穿刺進(jìn)入胰管，以0.1 mL/min逆行性經(jīng)微量注射泵緩慢勻速注入5%牛磺膽酸鈉（0.1 mL/100g），維持3 min后，見胰腺出現(xiàn)出血、壞死樣改變后，退出針頭，去除血管夾，關(guān)閉腹腔。分3次腹腔內(nèi)注射1 000mg/100g劑量的20% L-精氨酸溶液，每次間隔1 h。分組分籠飼養(yǎng)，不禁食水。假手術(shù)組大鼠僅行腹部手術(shù)處理。

1.4 干預(yù)方法 造模成功后，假手術(shù)組自由飲水進(jìn)食，模型組灌服純凈水，均尾靜脈注射生理鹽水10 mL/kg。實驗組灌服活血化瘀解毒方，高劑量實驗組予200 mg/kg，低劑量實驗組予50 mg/kg，尾靜脈注射生理鹽水10 mL/kg。陽性組以尾靜脈注射0.6%川芎嗪注射液10 mL/kg，灌胃10 mL生理鹽水。各組均每日給藥1次，持續(xù)24 h。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 1）血清淀粉酶（AMY）、尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平：抽取各組大鼠的股動脈血5 mL，離心后置于生化管中，用于檢測血清AMY、BUN和Cr水平。2）胰腺、腎臟組織病理學(xué)觀察：取血后，處死大鼠，取胰腺及腎臟組織，置于40 g/L多聚甲醛中固定，HE染色，光鏡下取5個視野進(jìn)行評分。采用改良Crewal法［4］進(jìn)行胰腺組織病理學(xué)評分，Smirh法［5］進(jìn)行腎臟組織病理學(xué)評分。3）炎癥因子的測定：收集3 mL心臟血液，離心，分離血清，ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-10及CRP炎癥因子水平水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。4）腎臟組織細(xì)胞凋亡檢測：采用膠原酶消化法分離大鼠腎臟細(xì)胞，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。腎臟組織細(xì)胞凋亡采用TU?NEL法進(jìn)行檢測，以細(xì)胞內(nèi)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)及顯色度，采用半定量法進(jìn)行計數(shù)。5）腎組織中Bax蛋白及Bcl-2蛋白表達(dá)測定：采血后，剪取3塊約1.0 cm3大小的腎實質(zhì)組織，于-19℃冷凍，逐步解凍后，剪碎腎臟組織勻漿，加入裂解液提取蛋白，4℃條件下，以12 000 r/min離心，取上清液，取20 μg蛋白樣品，滴加兔抗BAX或兔抗Bcl-2蛋白，PBS洗滌，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。采用ECL法顯色劑顯色，以GAPDH為參比，采用BCA法檢測Bax和Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平

2 結(jié) 果

2.1 各組胰腺組織病理學(xué)表現(xiàn) 見圖1。假手術(shù)組大鼠的胰腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)內(nèi)未見水腫、未見炎癥細(xì)胞浸潤。模型組大鼠的胰腺細(xì)胞大量死亡，間質(zhì)內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤并伴有水腫。給予藥物干預(yù)后，低劑量實驗組大鼠的胰腺細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤明顯并伴有大量水腫，胰腺細(xì)胞死亡明顯減少；陽性組和高劑量實驗組大鼠的胰腺細(xì)胞間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤伴有少量水腫及少量胰腺細(xì)胞壞死。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理觀察（HE染色，200倍）

2.2 各組腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn) 見圖2。假手術(shù)組大鼠的腎臟組織細(xì)胞無見明顯病理學(xué)改變。模型組大鼠的腎間質(zhì)瘀血、炎癥細(xì)胞浸潤，腎小球退行性變，腎小管管腔明顯狹窄并伴有水腫、壞死。給予藥物干預(yù)后，低劑量實驗組大鼠的腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤明顯并伴有大量水腫，死亡明顯減少；陽性組和高劑量實驗組大鼠的腎小管上皮間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤伴有輕度水腫及少量細(xì)胞壞死。

圖2 各組大鼠腎臟組織病理觀察（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠血清AMY、BUN、Cr、胰腺病理學(xué)評分以及腎臟病理學(xué)評分比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的血清AMY、BUN、Cr、胰腺病理學(xué)評分以及腎臟病理學(xué)評分明顯升高（P<0.05）。給予藥物干預(yù)后，陽性組和實驗組大鼠的血清AMY、BUN、Cr、胰腺病理學(xué)評分以及腎臟病理學(xué)評分明顯降低（P<0.05），低劑量實驗組大鼠的血清AMY、BUN、Cr、胰腺病理學(xué)評分以及腎臟病理學(xué)評分明顯高于陽性組和高劑量實驗組（P<0.05），而陽性組和高劑量實驗組間比較無明顯差異（P>0.05）。

表1 各組大鼠AMY、BUN、Cr水平及胰腺病理學(xué)評分、腎臟病理學(xué)評分比較（±s）

表1 各組大鼠AMY、BUN、Cr水平及胰腺病理學(xué)評分、腎臟病理學(xué)評分比較（±s）

與假手術(shù)組比較，?P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與低劑量實驗組比較，▲P<0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組陽性組低劑量實驗組高劑量實驗組n 15 15 15 15 15 AMY（IU/L）1 125.00±20.50 3 245.37±244.38*2 132.03±155.01*△▲2 839.24±264.14*△1 963.95±213.96*△▲Cr（μmol/L）38.12±2.87 75.28±4.26*42.98±3.42*△▲58.85±3.67*△43.15±4.05*△▲BUN（mmol/L）7.06±1.47 23.24±3.36*9.37±3.59*△▲15.64±4.12*△9.68±3.87*△▲胰腺病理學(xué)評分0.44±0.19 11.23±0.32*3.12±0.24*△▲5.43±0.62*△3.71±0.32*△▲腎臟病理學(xué)評分0.61±0.17 7.47±0.36*0.97±0.25*△▲1.85±0.16*△1.07±0.24*△▲

2.4 各組大鼠炎癥因子水平比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的TNF-α、IL-10、CRP以及 IL-6水平明顯升高（P<0.05）。給予藥物干預(yù)后，與模型組比較，陽性組和實驗組大鼠的炎癥因子水平明顯降低（P<0.05），低劑量實驗組大鼠的炎癥因子明顯高于陽性組和高劑量實驗組（P<0.05），而陽性組和高劑量實驗組間比較無明顯差異（P>0.05）。

表2 各組大鼠炎癥因子水平比較（±s）

表2 各組大鼠炎癥因子水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組陽性組低劑量實驗組高劑量實驗組n 15 15 15 15 15 TNF-α（μg/mL）39.73±6.09 65.57±7.24*41.98±7.05*△▲43.27±5.94*△42.35±7.23*△▲CRP（mg/mL）4.53±0.67 7.52±0.85*4.76±0.54*△▲4.95±0.46*△4.82±0.71*△▲IL-10（pg/mL）15.14±4.59 86.23±13.12*24.12±11.74*△▲35.43±10.62*△25.47±5.26*△▲IL-6（pg/mL）21.12±2.67 99.47±13.86*43.76±8.45*△▲55..89±9.56*△44.07±8.09*△▲

2.5 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠各時間點凋亡指數(shù)均明顯高于假手術(shù)組（P<0.05）。給予藥物干預(yù)后，與模型組比較，陽性組和實驗組大鼠各時間點凋亡指數(shù)明顯降于模型組（P<0.05），且隨時間延長而增加，低劑量實驗組大鼠各時間點凋亡指數(shù)明顯明顯高于陽性組和高劑量實驗組（P<0.05），而陽性組和高劑量實驗組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表3 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s）

表3 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組陽性組低劑量實驗組高劑量實驗組n 15 15 15 15 15 6 h 1.21±0.42 9.37±0.38*4.03±0.91*△▲5.24±4.14*△4.15±3.96*△▲12 h 1.25±0.27 12.28±0.76*5.98±1.02*△▲7.85±3.67*△6.15±1.05*△▲24 h 1.32±0.47 15.24±0.66*7.37±1.59*△▲9.64±4.12*△7.68±1.17*△▲

2.6 各組大鼠Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 見表4。假手術(shù)組大鼠的Bax蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)較弱。模型組大鼠的Bax蛋白表達(dá)明顯增強，以腎小管區(qū)為主，且隨著時間延長逐漸增高；Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低。給予藥物干預(yù)后，各用藥組Bax基因表達(dá)下調(diào)，各時間點Bax表達(dá)值較同時間模型組明顯降低（P<0.05），仍高于假手術(shù)組，Bax水平隨著時間延長而逐漸增高的趨勢，陽性組和高劑量實驗組的Bax蛋白表達(dá)明顯低于低劑量實驗組（P<0.05）。各用藥組各時間點Bcl-2蛋白表達(dá)值較同時間模型組明顯升高，陽性組和高劑量實驗組的Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于低劑量實驗組（P<0.05），陽性組和高劑量實驗組間的Bax蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)比較無顯著差異（P>0.05）。

表4 各組大鼠Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表4 各組大鼠Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較（±s）

Bax Bcl-2組別n假手術(shù)組模型組陽性組低劑量實驗組高劑量實驗組15 15 15 15 15 6 h 1.24±0.34 5.21±0.49*3.96±0.35*△▲4.47±0.61*△4.13±0.57*△▲12 h 1.27±0.57 7.23±0.84*5.13±0.78*△▲6.32±0.62*△5.65±0.81*△▲24 h 1.33±0.49 8.57±0.64*5.39±0.75*△▲6.87±0.94*△5.74±0.59*△▲6 h 1.22±0.14*0.71±0.13*0.81±0.16*△▲0.77±0.17*△0.80±0.41*△▲12 h 1.24±0.31*0.81±0.10*0.94±0.14*△▲0.87±0.15*△0.92±0.11*△▲24 h 1.31±0.27*0.78±0.09*1.15±0.12*△▲0.96±0.09*△1.10±0.14*△▲

3 討 論

重癥胰腺炎是由胰腺的局部炎癥快速發(fā)展形成的全身炎性反應(yīng)，其死亡率高，并發(fā)其他重要臟器功能衰竭［4］。重癥胰腺炎合并腎損傷是多因素參與的復(fù)雜的病理過程，細(xì)胞凋亡參與了重癥胰腺炎時急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展，炎癥因子的高度表達(dá)是其發(fā)生的主要機制［5］。炎癥因子進(jìn)入腎臟血液循環(huán)使血流動力學(xué)發(fā)生紊亂，持續(xù)性缺血低灌注血，進(jìn)而引發(fā)腎損傷。血清TNF-α、IL-6和IL-10作為重癥胰腺炎時大量釋放的炎癥因子，導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)，并可刺激CRP合成，激發(fā)過度免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腎臟功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)［6］，Bax及Bcl-2蛋白參與重癥胰腺炎大鼠的腎臟組織損傷過程。Bax是線粒體途徑重要的促凋亡因子，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bcl-2為高度同源蛋白中的經(jīng)典的抗凋亡蛋白，不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡而且在調(diào)控細(xì)胞自噬的過程中也有重要作用［7］。此外，Bcl-2還能調(diào)控氧化應(yīng)激誘導(dǎo)自噬和凋亡［8］。Bax拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用同時，還可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2可競爭性地與Bax結(jié)合，中和Bax誘導(dǎo)凋亡的作用，減少細(xì)胞凋亡。

重癥胰腺炎屬于中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”“脾熱病”和“結(jié)胸病”的范疇。中醫(yī)認(rèn)為其治則應(yīng)清熱燥濕、泄熱毒、下瘀血、行積滯以及疏肝理氣?；钛鼋舛痉绞窃簝?nèi)協(xié)定處方，具有清熱解毒、瀉下、活血化瘀的功效。方中重用生大黃蕩滌腸胃、峻下實熱、解毒祛瘀。配以板藍(lán)根、白花蛇舌草和水牛角增加清熱解毒之效，赤芍、丹參、川芎清熱活血化瘀，瓜蔞清熱化痰、寬胸散結(jié)，甘草調(diào)和諸藥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大黃中游離蒽醌類化合物可抑制局部炎癥反應(yīng)，阻斷多器官功能障礙的發(fā)生［9］，減低病理學(xué)評分［10］。丹參酮ⅡA對急性胰腺炎大鼠明顯改善藥理學(xué)癥狀，減輕炎性細(xì)胞浸潤［11］。近年研究發(fā)現(xiàn)［12］，腸源性內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致重癥胰腺炎繼發(fā)感染，川芎嗪可清除氧自由基，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，降低炎癥遞質(zhì)的釋放，增加臟器微循環(huán)血流量，已廣泛用于臨床各種疾病的治療［13-16］。

本研究結(jié)果顯示，給予藥物干預(yù)后，陽性組和實驗組大鼠的AMY、Cr、BUN、胰腺病理學(xué)評分、腎臟病理學(xué)評分以及炎癥因子水平明顯降低。提示活血化瘀解毒方能有效改善重癥胰腺炎合并急性腎損傷大鼠的血清淀粉酶、肌酐、尿素氮、胰腺病理學(xué)評分以及腎臟病理學(xué)評分，低劑量實驗組大鼠的TNF-α、IL-10、CRP以及IL-6水平明顯高于陽性組和高劑量實驗組（P<0.05），陽性組和高劑量實驗組間比較無顯著差異（P>0.05）。提示活血化瘀解毒方能有效降低重癥胰腺炎合并急性腎損傷大鼠炎癥因子水平。給予藥物干預(yù)后，與模型組比較，陽性組和試驗組大鼠的炎癥因子水平明顯降低（P<0.05），Bax蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，低劑量實驗組大鼠的炎癥因子和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于陽性組和高劑量實驗組，Bax蛋白表達(dá)明顯低于陽性組和高劑量實驗組，而陽性組和高劑量實驗組間比較無顯著差異（P>0.05）。提示活血化瘀解毒方能有效降低重癥胰腺炎合并急性腎損傷大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。

綜上所述，活血化瘀解毒方可有效降低重癥胰腺炎合并急性腎損傷大鼠相關(guān)炎癥因子水平、AMY、Cr、BUN水平，減少腎臟阻止細(xì)胞凋亡，改善胰腺以及腎臟病理學(xué)、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)。