注射用益氣復(fù)脈（凍干）對膿毒癥誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的改善作用研究?

潘雪薇 薛漓軒 張佳智 代玉潔 李 芳 張媛媛 寇俊萍 △

（1.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198；2.江蘇省中藥評價與轉(zhuǎn)化重點實驗室，江蘇 南京211198）

急性肺損傷（ALI）是由膿毒癥、肺炎、創(chuàng)傷、急性胰腺炎等因素引起的臨床危重病，死亡率高達(dá)35%～40%，以急性、彌漫性和炎性肺部損傷為特點，主要表現(xiàn)為肺泡毛細(xì)血管通透性增加，血管滲漏，引起肺部水腫甚至嚴(yán)重的低氧血癥［1］。膿毒癥是感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)所致的致命性器官功能障礙［2］，在膿毒癥引起的多器官功能損傷過程中，最先受到打擊的器官是肺，同時，ALI又是引起膿毒癥患者器官功能衰竭和死亡的獨立危險因素［3］。因此，改善ALI是膿毒癥治療的重要治療方向。近年來中醫(yī)藥的發(fā)展為膿毒癥急性肺損傷治療提供了新的突破口。中藥在降低炎性指標(biāo)、清除氧自由基和維持機體平衡方面顯示出一定的優(yōu)勢，部分清熱解毒、活血化瘀、通里攻下和補益類中藥復(fù)方或單味中藥對膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷顯示出明顯的改善效果［4］。注射用益氣復(fù)脈（凍干）是經(jīng)典名方“生脈散”經(jīng)現(xiàn)代化工藝提取和制備的凍干粉針劑，主要用于治療氣陰兩虛型心絞痛與心功能不全［5］。臨床實驗結(jié)果表明，膿毒癥患者在早期目標(biāo)導(dǎo)向治療外靜脈滴注益氣復(fù)脈可顯著改善器官組織低灌注和組織缺血，調(diào)節(jié)氧代謝，降低膿毒癥患者死亡率［6］。此外，前期研究證明益氣復(fù)脈（凍干）可以改善血管內(nèi)皮屏障功能障礙及氣管滴注脂多糖或細(xì)顆粒引起的ALI［7-8］，但其是否可以改善膿毒癥誘導(dǎo)的ALI尚不清楚。因此，本研究從肺微血管內(nèi)皮屏障功能損傷的角度出發(fā)，考察了益氣復(fù)脈（凍干）對膿毒癥所致小鼠ALI的改善作用，為其臨床用于膿毒癥ALI的防治提供一定實驗基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性C57BL/6J小鼠18～22 g，共210只，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動物許可證號：SCXK（蘇）2017-0007。所有動物飼養(yǎng)于相對濕度40%～60%，室溫24～26℃，12 h晝夜交替的SPF級動物實驗房中。

1.2 藥物與儀器 注射用益氣復(fù)脈（凍干）（天津天士力天之驕藥業(yè)有限公司，批號：20170311）；地塞米松（Biosharp生物科技公司，批號：BS134B）；伊文思藍(lán)（美國Sigma公司，批號：E2129）；TLR4抗體、VE-cadherin抗體（美國Santa Cruz公司，批號分別為sc-293072、sc-9989）；p120-catenin抗體（美國Abcam公司，批號：ab92514）；P-Src（Y416）抗體、Src抗體（美國CST公司，批號分別為6943S、2108S），髓過氧化物酶（MPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A044-1-1）。NanoZoomer 2.0 RS型數(shù)碼病理切片掃描儀（日本Hamamatsu公司）；Infinite 200Pro酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；1645050型濕法電轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；冰凍切片機（德國Leica公司）；LSM 700激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.3 分組與給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5 d后將小鼠隨機分為6組（每組35只）：假手術(shù)組、模型組、益氣復(fù)脈低劑量組（1 g/kg）、益氣復(fù)脈中劑量組（2 g/kg）、益氣復(fù)脈高劑量組（4 g/kg）和地塞米松組（5 mg/kg）。各組小鼠于造模前禁食12 h，各給藥組尾靜脈注射相應(yīng)劑量藥物，假手術(shù)組和模型組注射等體積（0.1 mL/10 g）生理鹽水。

1.4 模型制備 各組小鼠藥物干預(yù)后1 min立即進行盲腸結(jié)扎再穿孔（CLP）造模，腹腔注射4%的水合氯醛麻醉，固定于手術(shù)臺上，剃去腹毛。沿小鼠腹白線剪開約1 cm，分離表皮和肌層，在腹腔中鈍性分離盲腸和腸系膜，用5-0縫合線在盲腸全長75%處結(jié)扎。用16號針頭在盲腸末端以上由腸系膜側(cè)向非腸系膜側(cè)貫穿盲腸2次，避開血管，從針孔的兩端擠出少量腸內(nèi)容物，將盲腸放回腹腔，盡量避免腸內(nèi)容物黏附在手術(shù)切口，逐層縫合關(guān)腹，碘酒消毒傷口后，將小鼠放入裝有干凈墊料且可自由飲食的鼠籠中。假手術(shù)組只開關(guān)腹，不結(jié)扎和穿孔盲腸，手術(shù)過程中使用恒溫毯維持小鼠肛溫37℃。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）HE染色檢測肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。造模后18 h，每組取3只小鼠處死，取左上葉肺組織，4%多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋，切片染色，數(shù)字病理切片掃描儀掃描切片。剩余肺組織用于Western blotting及免疫熒光實驗。2）肺組織濕重/干重比測定。每組取8只小鼠，取肺部組織并精確測定質(zhì)量，記為肺濕重，再將肺組織置于120℃的烘箱中烘干48 h后測定質(zhì)量，為肺干重，計算肺濕重/干重比以確定肺組織水腫程度。3）肺泡灌洗液（BALF）檢測。每組取8只動物，剝離小鼠氣管，用4號針頭注射器對肺泡進行灌洗，用500 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗3次，回收的BALF（4℃，1 500 r/min離心5 min）離心后棄去上清液，用800 μL PBS重懸沉淀后檢測。4）MPO含量測定。每組取8只小鼠，采集血漿、肺泡灌洗液及肺組織勻漿，嚴(yán)格按照MPO試劑盒測定說明書進行實驗操作。5）伊文思藍(lán)（EB）檢測肺微血管通透性。每組取8只動物，造模16 h后，尾靜脈注射EB溶液（50 mg/kg），2 h后麻醉小鼠，用生理鹽水從小鼠心臟處灌注，取肺、拍照、吸干多余水分、稱重。每100 mg肺組織加入1 mL甲酰胺進行勻漿，60℃孵育18 h，5 000g離心30 min后取上清，于620 nm波長下測定，按標(biāo)曲計算EB滲漏量。6）Western blotting法檢測肺組織中蛋白表達(dá)。造模18 h后提取肺組織蛋白，定量后采用SDS-PAGE凝膠電泳，200 mA濕法轉(zhuǎn)膜，用5% BSA封閉2 h，4℃孵育一抗過夜，室溫孵育二抗1.5 h后使用增強型化學(xué)發(fā)光液顯影，通過凝膠成像儀拍照，分析蛋白表達(dá)水平。7）免疫熒光法檢測肺組織切片相關(guān)蛋白表達(dá)。取肺組織于4%多聚甲醛中固定24 h，40%蔗糖溶液脫水至組織沉底。將脫水后的組織用OCT膠固定在包埋盒中，去除氣泡后，于冰凍切片機內(nèi)速凍并切片（厚8 μm），吸附于黏附載玻片上。將肺組織切片用PBS浸洗3次，每次5 min，封閉液（5% BSA、0.2% Triton X-100的PBS）室溫封閉1 h，4℃孵育一抗過夜。PBS浸洗后室溫孵育二抗1.5 h，PBS浸洗后用DAPI染色5 min，PBS浸洗后滴加少量抗熒光猝滅封片液，蓋玻片封片，激光共聚焦觀察拍照。

2 結(jié) 果

2.1 各組膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織病理形態(tài)觀察 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠肺泡坍塌，肺泡壁充血并伴有炎性細(xì)胞浸潤，肺部血管水腫，氣管周圍有輕度炎癥，而益氣復(fù)脈和地塞米松能不同程度地改善小鼠肺組織病理學(xué)損傷。見圖1。

圖1 各組膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織病理形態(tài)（HE染色，100倍）

2.2 各組膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠肺水腫情況比較見表1。相比于假手術(shù)組，模型組小鼠肺組織濕干重比顯著升高（P<0.01），提示肺部水腫嚴(yán)重，低、中、高劑量益氣復(fù)脈組小鼠的肺濕干重比均較模型組有所降低。經(jīng)統(tǒng)計，與模型組相比，益氣復(fù)脈低、中劑量組可以顯著降低膿毒癥引起的小鼠肺部水腫（P<0.05或P<0.01），其中益氣復(fù)脈中劑量組改善作用最顯著。

表1 各組膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠肺水腫情況比較（±s）

表1 各組膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠肺水腫情況比較（±s）

注：與模型組比較，?P<0.05，??P<0.01；與益氣復(fù)脈低劑量組比較，$P<0.05，$$P<0.01；與益氣復(fù)脈中劑量組比較，&P<0.05，&&P<0.01；與地塞米松組比較，△P<0.05，△△P<0.01。下同。

組別假手術(shù)組模型組益氣復(fù)脈低劑量組益氣復(fù)脈中劑量組益氣復(fù)脈高劑量組地塞米松組n 8 8 8 8 8 8肺濕重/干重比4.79±0.21**5.59±0.14 5.23±0.29*&△△4.87±0.14**$△△5.29±0.17&&△5.67±0.34$$&&EB滲漏量（μg/g）33.50±4.80**77.87±8.44 35.21±5.72**31.91±2.43**39.47±7.41**51.33±8.78**

2.3 各組膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠BALF中細(xì)胞數(shù)目比較 見表2。與假手術(shù)組相比，模型組小鼠BALF中白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)目均顯著增加（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，益氣復(fù)脈中、高劑量組和地塞米松組BALF中白細(xì)胞數(shù)目顯著降低（P<0.01），其中益氣復(fù)脈中劑量組可以顯著抑制肺微血管中白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞滲漏到肺泡腔（P<0.05）。

表2 各組膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠BALF中細(xì)胞數(shù)目比較（×104個±s）

表2 各組膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠BALF中細(xì)胞數(shù)目比較（×104個±s）

組別假手術(shù)組模型組益氣復(fù)脈低劑量組益氣復(fù)脈中劑量組益氣復(fù)脈高劑量組地塞米松組n888888白細(xì)胞數(shù)0.18±0.05**0.81±0.46 0.49±0.18 0.29±0.14**0.35±0.07**0.35±0.14**中性粒細(xì)胞數(shù)0.03±0.02*0.16±0.16 0.12±0.06 0.04±0.02*0.11±0.02 0.07±0.03淋巴細(xì)胞數(shù)0.05±0.02**0.34±0.24 0.23±0.09 0.08±0.02*0.14±0.05 0.18±0.12

2.4 各組膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織勻漿、BALF和血漿中MPO活力的比較 見表3。相比于假手術(shù)組，模型組小鼠肺組織勻漿、BALF和血漿中MPO活力均顯著增強（P<0.01），益氣復(fù)脈低、中劑量組和地塞米松組均可顯著抑制膿毒癥誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織、BALF和血漿中MPO活力的增加（P<0.05或P<0.01），益氣復(fù)脈高劑量組可顯著降低膿毒癥誘導(dǎo)ALI小鼠BALF和血漿中MPO的活力（P<0.01）。

表3 各組膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織勻漿、BALF和血漿中MPO活力的比較（±s）

表3 各組膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織勻漿、BALF和血漿中MPO活力的比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組益氣復(fù)脈低劑量組益氣復(fù)脈中劑量組益氣復(fù)脈高劑量組地塞米松組n 8 8 8 8 8 8肺中MPO（U/g）0.41±0.16**1.28±0.16 1.03±0.24**&△△0.86±0.17**$△△1.11±0.15&&△△0.64±0.11**$$&&△△BALF中MPO（U/L）42.27±2.73**94.41±9.00 62.70±12.44*49.79±4.18**59.00±5.35**53.46±6.33**血漿中MPO（U/L）122.74±5.74**266.89±22.61 181.79±28.72**△△142.32±9.21**130.50±8.16**94.01±11.57**$$

2.5 各組膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織EB滲漏程度的比較 見圖2，表1。膿毒癥誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷后肺組織EB滲漏明顯（P<0.01），益氣復(fù)脈各劑量組及地塞米松組均能顯著降低小鼠EB滲漏情況（P<0.01），中劑量組效果最顯著。結(jié)果提示益氣復(fù)脈可以顯著抑制膿毒癥引起的小鼠肺微血管內(nèi)皮屏障完整性的破壞，進而改善ALI。

圖2 各組膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織EB滲漏程度

2.6 各組膿毒癥誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織中VE-cadherin和p120-catenin表達(dá)比較 見圖3、圖4和表4。上述實驗結(jié)果表明，益氣復(fù)脈中劑量組改善膿毒癥誘導(dǎo)ALI的效果最佳，后續(xù)選取中劑量益氣復(fù)脈進一步操作。模型組小鼠肺組織中VE-cadherin和p120-catenin蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01），而益氣復(fù)脈中劑量組可顯著增加肺組織中VE-cadherin和p120-catenin的蛋白表達(dá)（P<0.05或P<0.01）。綜上所述，益氣復(fù)脈可能是通過抑制VE-cadherin和p120-catenin表達(dá)的下降，恢復(fù)黏附連接，改善膿毒癥小鼠肺微血管內(nèi)皮屏障功能，進而改善ALI。

表4 各組膿毒癥誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織中VE-cadherin和p120-catenin表達(dá)比較（±s）

表4 各組膿毒癥誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織中VE-cadherin和p120-catenin表達(dá)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組中劑量益氣復(fù)脈組n 3 3 3 VE-cadherin/β-actin 1.00±0.11**0.31±0.21 0.82±0.22*p120-catenin/β-actin 1.00±0.10**0.12±0.07 0.94±0.21**

圖3 各組膿毒癥誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織中VE-cadherin和p120-catenin表達(dá)的影響

圖4 各組膿毒癥誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織中VE-cadherin和p120-catenin表達(dá)

2.7 各組膿毒癥誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織中Src磷酸化和TLR4表達(dá)的比較 見圖5，表5。相比于假手術(shù)組，模型組小鼠肺組織中Src磷酸化水平和TLR4表達(dá)顯著升高（P<0.01），中劑量益氣復(fù)脈組可顯著抑制膿毒癥小鼠肺組織中Src磷酸化水平和TLR4表達(dá)水平（P<0.05）。

表5 各組膿毒癥誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織中Src磷酸化和TLR4表達(dá)比較（±s）

表5 各組膿毒癥誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織中Src磷酸化和TLR4表達(dá)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組益氣復(fù)脈中劑量組n 3 3 3 p-Src/Src 1.00±0.12**2.62±0.72 1.28±0.37*TLR4/β-actin 1.00±0.20**2.06±0.38 1.12±0.27*

圖5 各組膿毒癥誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織中Src磷酸化和TLR4的表達(dá)

3 討 論

肺主氣，司呼吸，且肺為嬌臟，易受外邪侵?jǐn)_，使肺失宣降功能，其通調(diào)水道功能也受到影響，膀胱氣化不利，水液運行障礙，導(dǎo)致機體內(nèi)水液積聚，形成水腫［9］。此外，臨床上膿毒癥患者皮下和體腔也通常會發(fā)生水腫，這也與中醫(yī)理論“肺與大腸相表里”相符合［10］。膿毒癥合并ALI患者全身內(nèi)皮通透性的增加，引起的機體水腫會顯著增加患者死亡率［11］。肺泡-毛細(xì)血管屏障完整性被破壞引起血管內(nèi)皮彌漫性損傷，炎性細(xì)胞活化是ALI的基本病理特征，也是膿毒癥引起的多器官功能損傷的重要環(huán)節(jié)［12］。因此，保護膿毒癥中肺臟的功能，是治療膿毒癥合并ALI的重要治療靶標(biāo)。

益氣復(fù)脈來自經(jīng)典名方生脈散，由紅參、麥冬、五味子3味藥物組成，臨床上常用來治療冠心病心絞痛、慢性心衰等疾病，偶見用于慢性阻塞性肺疾病，改善中晚期肺癌患者生存質(zhì)量［13］。其中紅參為人參熟制品，味甘、微苦、性微溫，歸脾、肺、心、腎經(jīng)，具大補元氣、復(fù)脈固脫、補脾益肺等功效；麥冬味甘、微苦，性微寒，歸心、肺、胃經(jīng)，具滋陰生津、潤肺清心之功效；五味子味酸、甘，性溫，歸肺、心、腎經(jīng)，具收斂固澀、益氣生津、補腎寧心之功效［14］。前期研究顯示，益氣復(fù)脈中多種有效成分均可以改善膿毒癥及膿毒癥相關(guān)的器官損傷［8］。然而，益氣復(fù)脈對于膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠肺損傷的影響未見報道。

CLP模型是實驗室復(fù)制膿毒癥模型的金標(biāo)準(zhǔn)，是由腹部手術(shù)引起的創(chuàng)傷、盲腸結(jié)扎導(dǎo)致的組織壞死以及腸道內(nèi)菌群的泄露引起的腹部感染。該模型操作簡單，可重復(fù)性高，廣泛應(yīng)用于膿毒癥的病理生理研究［15］。在ALI的發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥激活巨噬細(xì)胞，并將中性粒細(xì)胞招募至毛細(xì)血管來殺滅病原體，MPO會隨中性粒細(xì)胞浸潤釋放到炎癥部位［16］。此外，毛細(xì)血管內(nèi)皮屏障被破壞導(dǎo)致了中性粒細(xì)胞從血管滲漏到肺泡腔，中心粒細(xì)胞的遷移和活化是ALI進程中與炎癥反應(yīng)和肺水腫相關(guān)的重要事件［17］。本文結(jié)果顯示模型組小鼠肺組織病理形態(tài)損傷嚴(yán)重、炎性細(xì)胞及MPO水平升高、肺水腫及肺微血管內(nèi)皮通透性顯著增加，而益氣復(fù)脈可顯著改善小鼠肺組織病理損傷、減輕肺部炎癥反應(yīng)、降低肺水腫及內(nèi)皮通透性，從而改善膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠肺損傷。

TLR4是一種Ⅰ型跨膜蛋白，可以識別高度保守病原相關(guān)分子，從而啟動先天免疫反應(yīng)和炎癥［18］。據(jù)報道，TLR4信號通路的激活在病毒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和隨后的細(xì)胞因子風(fēng)暴中起著至關(guān)重要的作用，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的ALI，急性呼吸窘迫綜合征，MODS甚至死亡［19］。TLR4的激活可通過促進Src磷酸化，導(dǎo)致VE-cadherin和p120-catenin的酪氨酸磷酸化及降解，增加內(nèi)皮通透性，引起肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的彌漫性損傷［20］。本文結(jié)果顯示益氣復(fù)脈可以通過抑制膿毒癥模型誘導(dǎo)的TLR4的激活和Src的磷酸化，恢復(fù)肺血管內(nèi)皮VE-cadherin和p120-catenin的表達(dá)，降低肺血管內(nèi)皮通透性，進而抑制膿毒癥引起的小鼠肺組織、BALF及血漿中MPO的活化以及炎性細(xì)胞浸潤，改善肺病理學(xué)損傷及肺水腫，改善膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠ALI。

綜上所述，益氣復(fù)脈可能是通過調(diào)節(jié)TLR4/Src/VE-cadherin/p120-catenin信號通路，進而維持小鼠肺血管內(nèi)皮屏障功能，改善膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠肺組織彌漫性損傷，抑制血管中炎癥細(xì)胞滲漏到肺泡腔及肺組織中性粒細(xì)胞遷移浸潤，進而改善ALI。提示益氣復(fù)脈對于臨床治療膿毒癥合并ALI的潛在可能性。但其具體如何調(diào)節(jié)肺血管內(nèi)皮屏障功能，對于膿毒癥引起的其他臟器損傷是否具有保護作用有待進一步研究。本研究結(jié)果為益氣復(fù)脈臨床應(yīng)用于膿毒癥或細(xì)菌、病毒引起的肺部疾病的防治提供了參考依據(jù)。