香葉木素對異丙腎上腺素誘導的小鼠心肌肥大的抑制作用及其機制

王平麗,張申偉,李 江

（1.河南醫(yī)學高等?？茖W校外科教研室，河南 鄭州451191；2.河南省鄭州市第七人民醫(yī)院心內科，河南 鄭州 455000）

心血管系統(tǒng)疾病嚴重危害人類健康。據(jù)統(tǒng)計，2019年我國心血管病患者人數(shù)約為2.9億，且其發(fā)病率呈日益增加和發(fā)病年齡呈日趨年輕化的趨勢［1］。高血壓、心肌梗死和心臟瓣膜功能障礙等常見的心血管疾病均會加重心臟負荷［2-3］。心肌肥大是心臟為應對持續(xù)增加的心臟負荷而自動激活的代償性反應［2-4］。雖然早期的心肌肥大有利于心臟維持心輸出量，但其以心肌細胞過度耗氧為代價，心肌細胞長期過度耗氧會導致心肌缺氧并降低心肌順應性，故長期的心肌肥大可使心臟失代償，最終導致心力衰竭和心律不齊［5-6］。目前尚無應對心肌肥大的特異性治療藥物，故對心肌肥大治療藥物的開發(fā)和篩選具有重要意義。

香葉木素（diosmetin，Dio）是一種具有抗癌、抗氧化、抗炎、利尿和降壓等多種藥理活性的類黃酮苷的糖苷配基化合物［7］。在心臟疾病方面的研究中，MO等［8］發(fā)現(xiàn)：Dio可通過降低氧化應激和心肌細胞凋亡來減輕新生大鼠的心肌梗死程度和增加心肌收縮力；MEEPHAT等［9］發(fā)現(xiàn)：Dio能改善高脂飲食誘導的肥胖大鼠的左心室室壁增厚和纖維化。以上研究提示：Dio可能具有潛在的抗心肌肥大的作用，但尚無有關直接評估Dio對心肌肥大具體指標潛在影響。因此，本研究探討了Dio在異丙腎上腺素（isoprenaline，Iso）誘導的小鼠心肌肥大模型中的作用，并分析其中潛在的生物學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器SPF級雄性昆明小鼠28只，6周齡，體質量30～32 g，購于河南省實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2017-0001，飼養(yǎng)于SPF級動物房。Dio（純度＞99%，武漢貝爾卡生物醫(yī)藥有限公司），Iso（美國Sigma公司），異硫氰酸熒光素標記的凝集素（FITCLectin，美國Trevigen公司），蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒和Masson三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），小鼠源α-肌球蛋白重鏈（α-myosin heavy chain，α-MHC）抗體和小鼠源β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）抗體（美國Santa Cruz公司），兔源細胞外調節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）抗體、兔源磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）抗體、兔源c-Jun氨基末端激酶1/2（c-Jun N-terminal kinase 1/2，JUK 1/2）抗體、兔源磷酸化JUK 1/2（p-JUK 1/2）抗體和兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國Cell Signaling Technology公司），RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液試劑盒和辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記抗小鼠和抗兔二抗（上海碧云天生物科技有限公司）。Axio ScopeA 1型熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss公司），iMark型酶標儀（美國Bio-Rad公司），蛋白質電泳-電轉系統(tǒng)（北京百晶生物技術有限公司）。

1.2 實驗動物分組和標本收集28只小鼠適應飼養(yǎng)3 d后，隨機分為對照組、模型組、低劑量Dio組和高劑量Dio組，每組7只。按照文獻［10］的方法，模型組、低劑量Dio組和高劑量Dio組小鼠連續(xù)14 d經(jīng)背部皮下注射Iso（5 mg·kg－1·d－1）構建小鼠心肌肥大模型，對照組小鼠注射等體積的生理鹽水，低和高劑量Dio組小鼠同時連續(xù)14 d腹腔注射Dio（5和20 mg·kg－1·d－1）。14 d后，腹腔注射過量的戊巴比妥鈉（200 mg·kg－1）處死小鼠，收集心臟和脛骨。電子天平稱量心臟質量（heart weight，HW）和左心室質量（left ventricular weight，LVW），用游標卡尺測量脛骨長度（tibial length，TL）后，分別計算各組小鼠的心臟質量指數(shù)和左心室質量指數(shù)。心臟質量指數(shù)=HW（mg）/TL（mm）；左心 室質 量指數(shù)=LVW（mg）/TL（mm）。

1.3 HE、FITC-Lectin和Masson染色觀察分析小鼠左心室心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)分別取各組小鼠的左心室組織，用石蠟包埋后，采用橫切的模式，切為5μm厚度的心肌片。心肌片經(jīng)常規(guī)方案脫蠟和水化后，按照試劑盒說明書步驟，分別用HE、FITC-Lectin和Masson染色，并在顯微鏡下采用隨機視野法拍照各組小鼠左心室病理形態(tài)表現(xiàn)圖片。每只小鼠任取3個心肌片，每個心肌片任選5個隨機視野，采用Image Pro Plus 5.1圖像軟件分析心肌細胞大小和纖維化程度。心肌細胞大小的測量：每個橫切面視野下至少要測量50個心肌細胞的橫截面積，心肌細胞大小以每個心肌細胞橫截面積的平均值表示。纖維化程度以每個心肌片Masson染色面積所占百分率的平均值表示。

1.4 免疫組織化學染色檢測小鼠左心室心肌組織中α-MHC和β-MHC蛋白表達水平分別取各組小鼠左心室的心肌片（厚度5μm），常規(guī)方案脫蠟、水化和0.3%H2O2處理后，用血清室溫封閉30 min，然后分別按照1∶200的稀釋比例在室溫下孵育α-MHC和β-MHC抗體45 min；PBS緩沖液沖洗3次后，采用1∶200的稀釋比例的HRP標記的抗小鼠二抗室溫孵育30 min；PBS緩沖液再次沖洗3次后，用SP復合物室溫孵育20 min；PBS緩沖液再次沖洗后，采用DAB顯色液顯色，并用蘇木素染核，然后依次水洗、藍化、脫水、透明和封片后，在顯微鏡下采用隨機視野法拍照。每只小鼠任取3個心肌片，每個心肌片任選5個隨機視野，用Image Pro Plus 5.1圖像分析軟件檢測α-MHC和β-MHC陽性染色的吸光度（A）值。α-MHC或β-MHC蛋白表達水平＝處理組α-MHC或β-MHC陽性染色A值/對照組α-MHC或β-MHC陽性染色A值×100%。

1.5 Western blotting法檢測小鼠左心室心肌組織中p-ERK 1/2和p-JUK 1/2蛋白表達水平分別取各組小鼠左心室心肌組織，采用RIPA裂解液分離出總蛋白質。采用BCA蛋白定量試劑盒對各組分離的總蛋白質進行定量至相同濃度后，并分別取等量蛋白進行10%SDS-PAGE電泳。電泳后，將蛋白電轉至甲醇活化的PVDF膜上，然后采用5%脫脂奶粉室溫封閉膜30 min。封閉后，分別室溫孵育一抗（1∶3 000稀釋比例的ERK1/2和JUK1/2，1∶1 000稀釋比例的p-ERK1/2和p-JUK1/2，1∶5 000稀釋比例的GAPDH）2 h。采用TBST洗滌膜后，室溫孵育HRP標記的抗兔二抗1 h。TBST再次洗滌膜后，用ECL發(fā)光液在暗室中使得目的條帶曝光于膠片。用Image Pro Plus 5.1圖像分析軟件檢測目的蛋白條帶的A值。目的蛋白表達水平以目的條帶A值與GAPDH條帶A值比值表示。p-ERK1/2或p-JUK1/2蛋白表達水平以p-ERK 1/2或p-JUK 1/2與ERK 1/2或JUK1/2蛋白表達水平比值×100%表示。

1.6 統(tǒng)計學分析采用Graph Pad 6.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組小鼠心臟質量指數(shù)、左心室質量指數(shù)、左心室心肌細胞橫截面積和纖維化程度以及左心室心肌組織中α-MHC、β-MHC、p-ERK1/2和p-JUK1/2蛋白表達水平經(jīng)正態(tài)性檢驗均呈正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠心臟質量指數(shù)和左心室質量指數(shù)與對照組比較，模型組小鼠心臟質量指數(shù)和左心室質量指數(shù)均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，不同劑量Dio組小鼠心臟質量指數(shù)和左心室質量指數(shù)明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），其中以高劑量Dio組降低尤為明顯（P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠心臟質量指數(shù)和左心室質量指數(shù)T ab.1Heart mass indexes and left ventricular mass indexes of mice in various groups (n=7,±s,mg·mm－1)

表1 各組小鼠心臟質量指數(shù)和左心室質量指數(shù)T ab.1Heart mass indexes and left ventricular mass indexes of mice in various groups (n=7,±s,mg·mm－1)

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model Dio Low dose High dose Heart mass index 7.32±0.35 9.29±0.49*8.41±0.29△7.95±0.55△△Left ventricular mass index 5.49±0.31 6.74±0.57*6.53±0.21△6.01±0.55△△

2.2 各組小鼠左心室心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn)對照組比較，模型組小鼠左心室心肌組織中心肌纖維破壞，出現(xiàn)炎性細胞浸潤，心肌細胞橫截面積明顯增加（P＜0.01）（HE染色），心肌組織微循環(huán)灌注減弱（FITC-Lectin染色），間質纖維化程度明顯增加（P＜0.01）（Masson染色）；與模型組比較，不同劑量Dio組小鼠心肌組織損傷明顯減輕，心肌細胞橫截面積明顯縮小（P＜0.05或P＜0.01），心肌組織微循環(huán)灌注增強，間質纖維化程度明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），其中以高劑Dio量組變化尤為明顯（P＜0.01）。見圖1和表2。

圖1 各組小鼠左心室心肌組織HE染色、FITC-Lectin染色和Masson染色結果（Bar=50μm）Fig.1Results of HE staining,FITC-Lectin staining and Masson staining of left ventricular myocardium tissue of mice in various groups(Bar=50μm)

表2 各組小鼠左心室心肌組織中心肌細胞橫截面積和纖維化程度Tab.2Cross-areas of myocardial cells and fibrosis degrees in left ventricular myocardium tissue of mice in various groups(n=7，±s）

表2 各組小鼠左心室心肌組織中心肌細胞橫截面積和纖維化程度Tab.2Cross-areas of myocardial cells and fibrosis degrees in left ventricular myocardium tissue of mice in various groups(n=7，±s）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model Dio Low dose High dose Cell cross-area(A/μm2)196.54±15.78 448.36±26.53*374.46±36.92△306.78±28.31△△Fibrosis degree(η/%)2.13±1.31 32.56±4.69*14.25±5.63△8.35±4.24△△

2.3 各組小鼠左心室心肌組織中α-MHC和β-MHC蛋白表達水平與對照組比較，模型組小鼠左心室心肌組織中α-MHC蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），β-MHC蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，不同劑量Dio組小鼠左心室心肌組織中α-MHC蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），β-MHC蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），其中以高劑量Dio組變化尤為明顯（P＜0.01）。見圖2和表3。

圖2 各組小鼠左心室心肌組織中α-MHC和β-MHC蛋白表達情況（免疫組織化學，Bar=10μm）Fig.2Expressions ofα-MHC andβ-MHC proteins in left ventricular myocardium tissue of mice in various groups(Immunohistochemistry,Bar=10μm)

表3 各組小鼠左心室心肌組織中α-MHC和β-MHC蛋白表達水平Tab.3Expression levels of a-MHC andβ-MHC proteins in left ventricular myocardium tissue of mice in various groups(n=7,±s,η/%)

表3 各組小鼠左心室心肌組織中α-MHC和β-MHC蛋白表達水平Tab.3Expression levels of a-MHC andβ-MHC proteins in left ventricular myocardium tissue of mice in various groups(n=7,±s,η/%)

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model Dio Low dose High dose a-MHC 102.31±5.64 14.42±2.19*34.82±6.93△57.36±5.72△△β-MHC 101.78±9.86 362.21±43.77*271.52±25.86△164.42±13.15△△

2.4 各組小鼠左心室心肌組織中p-ERK1/2和p-JNK 1/2蛋白表達水平與對照組比較，模型組小鼠左心室心肌組織中p-ERK1/2和p-JNK1/2蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，不同劑量Dio組小鼠左心室心肌組織中p-ERK1/2和p-JNK 1/2蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），其中以高劑量Dio組降低尤為明顯（P＜0.01）。見圖3和表4。

圖3 各組小鼠左心室心肌組織中p-ERK1/2、ERK 1/2、p-JNK 1/2和JNK 1/2蛋白表達電泳圖Fig.3Electrophoregram of expressions of p-ERK 1/2,ERK 1/2,p-JNK1/2 and JNK 1/2 proteins in left ventricular myocardium tissue of mice in various groups

表4 各組小鼠左心室心肌組織中p-ERK1/2和p-JNK 1/2蛋白表達水平Tab.4Expressionlevels of p-ERK 1/2andp-JNK1/2 proteins in left ventricular myocardium tissue of mice in various groups (n=7,±s,η/%)

表4 各組小鼠左心室心肌組織中p-ERK1/2和p-JNK 1/2蛋白表達水平Tab.4Expressionlevels of p-ERK 1/2andp-JNK1/2 proteins in left ventricular myocardium tissue of mice in various groups (n=7,±s,η/%)

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model Dio Low dose High dose p-ERK 1/2 98.45±8.27 373.64±32.31*285.49±45.27△171.69±30.24△△p-JNK 1/2 103.56±15.43 352.78±48.69*252.74±22.35△159.63±26.89△△

3 討 論

在心功能代償期，心肌肥大雖然有利于心臟維持心輸出量，但會造成心肌細胞過度耗氧，若心肌細胞長期過度耗氧會造成供氧不足，從而使心功能發(fā)展為失代償［5-6］。因此，病理性心肌肥大是與惡性心律失常和慢性心力衰竭相關的有害過程和危險因素［11］，抑制失代償?shù)男募》蚀罂赡苁穷A防慢性心力衰竭和其他心臟相關疾病的有用治療策略。心肌肥大主要病理形態(tài)表現(xiàn)為心肌細胞增大、心臟質量增加、纖維化和心肌重構［3-5］。心臟質量指數(shù)和左心室質量指數(shù)是常用的反映動物模型的心臟功能和心肌重構的重要指標，其升高代表心臟功能降低和左心室肥大重構［12］。本研究結果顯示：Dio能降低Iso誘導的心肌肥大小鼠的心臟質量指數(shù)和左心室質量指數(shù)，提示Dio能改善心肌肥大導致的心臟功能障礙和左心室肥大。另外，本研究通過病理形態(tài)學方法觀察到：Dio能抑制Iso誘導的小鼠心肌細胞增大、心肌微循環(huán)降低和心肌間質纖維化，表明Dio是潛在的抗心肌肥大的藥物。

肌球蛋白在心肌肥大的代償階段和失代償階段均發(fā)揮的重要作用。肌球蛋白主要有2條重鏈（α-MHC和β-MHC）和2條輕鏈（MLC1和MLC2）組成，其不僅是心肌肌原纖維的主要構成成分，也是其發(fā)揮收縮作用的主要動力蛋白［13］。成年小鼠心室肌的肌球蛋白主要以α-MHC表達為主，而當心肌肥大時，β-MHC再表達和α-MHC向β-MHC轉換導致β-MHC的比例增加，進而心肌收縮功能減弱［14-15］。而慢性心力衰竭正是由心肌收縮功能減弱導致，說明MHC中β-MHC的比例增加是心力衰竭發(fā)生的根本原因之一。因此，逆轉肥大心肌組織中β-MHC的比例能減緩甚至停滯心肌肥大向心力衰竭的進展。本研究結果顯示：Dio能抑制Iso誘導的小鼠心肌組織中β-MHC表達增加，且能促進α-MHC的表達，說明Dio能改善肥大心肌的收縮功能并能抑制心肌肥大向心力衰竭的進展。

已有研究［16-22］表明：絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信 號傳導途徑是心肌肥大發(fā)生發(fā)展的最主要信號通路。MAPKs主要由ERKs、JNKs和p38激酶組成。在上述激酶中，幾乎所有的肥大性刺激均涉及ERK 1/2激活，而ERK1/2的持續(xù)性激活能促使向心性肥厚的發(fā)生［18-19］。因此，ERK1/2信號激活被認為是心肌肥大反應必需的信號通路［18］。JNKs激活也在心肌肥大進展中發(fā)揮重大作用，研究［20］表明：JNK1/2的持續(xù)性激活能促使心肌肥大向心力衰竭進展。且已有研究［21-22］表明：抑制ERK1/2和JNK 1/2的信號活性能降低Iso誘導的心肌細胞肥大。本研究結果顯示：與對照組比較，模型組小鼠左心室心肌組織中p-ERK1/2和p-JNK1/2蛋白的表達水平升高，說明Iso能激活ERK 1/2和JNK 1/2信號；而Dio處理能明顯阻斷Iso誘導的ERK1/2和JNK1/2信號活性，提示Dio可能通過抑制ERK 1/2和JNK 1/2信號通路活性而發(fā)揮抵抗Iso誘導的心肌肥大的作用。

綜上所述，Dio可以抑制Iso誘導的小鼠心肌肥大并減輕心室間質纖維化，其機制可能與其抑制ERK1/2和JNK1/2信號通路活性有關。因此，Dio可能是治療心肌肥大和預防慢性心力衰竭的潛在候選藥物。