靶向沉默ATRX對(duì)輻射誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞周期阻滯和凋亡的作用

秦麗晶,韓 冰,李忠起,索 齊,賈 臻,崔紅麗,徐維強(qiáng),方 芳,王志成

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 國(guó)家衛(wèi)健委放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院放射線科，吉林 長(zhǎng)春130041；3.吉林國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，吉林 長(zhǎng)春130062；4.吉林省長(zhǎng)春愛(ài)爾匯鋒眼科醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041）

放射治療是腫瘤常規(guī)治療手段，射線導(dǎo)致DNA損傷后，細(xì)胞啟動(dòng)周期檢查點(diǎn)進(jìn)行DNA損傷修復(fù)，不能修復(fù)則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這也是腫瘤放療殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制之一。DNA損傷程度輕微情況下，細(xì)胞傾向于G1期修復(fù)［1］，主要進(jìn)行非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ），是DNA損傷修復(fù)的手段之一。大劑量輻射損傷時(shí)，腫瘤啟動(dòng)G2/M期阻滯有利于自身存活，主要通過(guò)同源重組（homologous recombination，HR）方式來(lái)修復(fù)受損的DNA［2］，因此尋找調(diào)控細(xì)胞周期阻滯和增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的腫瘤分子靶點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)。α-地中海貧血/精神發(fā)育遲滯綜合征X染色體相關(guān)蛋白（α-thalassemia/mental retardation syndrome X-linked，ATRX）是染色質(zhì)重塑蛋白，定位于異染色質(zhì)上，發(fā)揮DNA損傷修復(fù)、染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)周期調(diào)控等生物學(xué)功能［3-5］。本課 題 組 前 期 研究［6］顯示：靶向沉 默HeLa細(xì)胞的ATRX后，輻射誘導(dǎo)DNA損傷加重，修復(fù)能力降低，提示ATRX參與DNA損傷的修復(fù)，與已有的報(bào)道類(lèi)似［7］。本研究通過(guò)靶向沉默宮頸癌HeLa細(xì)胞的ATRX，進(jìn)一步研究輻射后細(xì)胞增殖、周期進(jìn)程和凋亡的變化，闡明ATRX與輻射所致的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為腫瘤放療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器靶向沉默ATRX的宮頸癌HeLa細(xì)胞由本課題組建立完成并保存［7］，命名為shATRX1-HeLa，以shCon-HeLa為陰性對(duì)照。MEM培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），青鏈霉素（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），CCK8試劑（日本同仁化學(xué)研究所），碘化丙啶（propidium iodide，PI）和RNase A（美國(guó)Sigma公司），AnnexinⅤ-PE/7-AAD試劑盒（美國(guó)BD公司），GAPDH、多聚（腺苷酸二磷酸核糖基）聚合酶1［poly（ADP-ribose）polymerase 1，PARP1］、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cleaved caspase-9）和裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）一抗（美國(guó)CST公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（HRP-二抗，美國(guó)Immunoway公司），其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。X射線輻照儀X-RAD 320iX（Precision X-ray，美國(guó)INC公司），垂直板電泳系統(tǒng)（美國(guó)BioRad公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性將shCon-HeLa和shATRX1-HeLa細(xì)胞按照4×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞80%～90%融合后，進(jìn)行0、2和8 Gy X射線照射，照射后0、6、10、24和48 h每孔加入200μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的吸光度（A）值，以細(xì)胞A（450）值代表細(xì)胞增殖活性。

1.3 PI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率將shCon-HeLa和shATRX1-HeLa細(xì)胞按照2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞80%～90%融合后，進(jìn)行0、2和8 Gy X射線照射，照射后24 h加入300μL無(wú)EDTA的胰酶消化，PBS緩沖液洗1次后，重懸細(xì)胞，加入500μL預(yù)冷的75%冰乙醇，4℃冰箱內(nèi)固定2 h，PBS緩沖液洗1次，每管加入RNase A（終濃度50 mg·L－1）8μL、PI（終 濃 度50 mg·L－1）30μL和10%Triton X-100 2μL混勻；避光30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率，CellQuest軟件收集細(xì)胞，ModFit軟件分析結(jié)果，至少收集1×104個(gè)細(xì)胞。

1.4 AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率按照“1.3”中的方法收取各組細(xì)胞后，PBS緩沖液洗1次，加入Binding Buffer懸浮細(xì)胞100μL，加入AnnexinⅤ-PE 5μL和7-AAD 5μL混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，每管補(bǔ)充Binding Buffer 400μL，吹打混勻后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，CellQuest軟件收集細(xì)胞，Mod Fit軟件分析結(jié)果，至少收集1×104個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率以百分率表示。

1.5 Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況將shCon-HeLa和shATRX1-HeLa細(xì)胞按照1×107個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞80%～90%融合后，進(jìn)行0、2和8 Gy X射線照射，照射后24和48 h收集各組細(xì)胞，并加入裂解液RIPA 100μL，提取總蛋白后進(jìn)行定量，取40μg蛋白加入5×Loading Buffer，100℃變性10 min后上樣。濃縮膠80 V，分離膠120 V，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜緩沖液4℃過(guò)夜?jié)褶D(zhuǎn)，5%脫脂奶粉封閉1 h，GAPDH、PARP1、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3一抗孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，加入由TBST稀釋的HRP-二抗后孵育1 h，TBST洗滌3次，加入ECL液A和B，暗室中曝光，拍照分析目的蛋白表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞增殖活性、不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率和凋亡率均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組HeLa細(xì)胞增殖活性與shCon-HeLa組比較，0、2和8 G y X射線照射后，不同時(shí)間點(diǎn)shATRX1-HeLa組細(xì)胞增殖活性均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），表明沉默ATRX后輻射對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用更明顯。見(jiàn)表1。

表1 不同劑量X射線照射后不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖活性T ab.1Proliferation activities of HeLa cells at different time points after different doses of X-ray irradiation in various groups（n=6，±s）

表1 不同劑量X射線照射后不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖活性T ab.1Proliferation activities of HeLa cells at different time points after different doses of X-ray irradiation in various groups（n=6，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with shCon-HeLa group.

Group shCon-HeLa 0 Gy 2 Gy 8 Gy shATRX1-HeLa 0 Gy 2 Gy 8 Gy Proliferation activity(t/h)0 0.99±0.19 0.81±0.12 0.93±0.09 0.73±0.12*0.67±0.09*0.74±0.06*6 0.95±0.14 0.78±0.08 1.05±0.15 0.92±0.07 0.62±0.08*0.71±0.16*10 1.17±0.19 1.07±0.17 1.25±0.27 0.87±0.14*0.80±0.14*0.80±0.04**24 1.81±0.22 1.64±0.16 1.49±0.07 1.38±0.06**1.37±0.12*1.13±0.13**48 2.98±0.33 2.58±0.15 1.98±0.11 2.16±0.16*1.97±0.10**1.70±0.18*

2.2 各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率與shCon-HeLa組比較，0 Gy X射線照射后shATRX1-HeLa組G2/M期細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.05），2 Gy X射線照射后shATRX1-HeLa組G0/G1期細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.05）、G2/M期細(xì)胞百分率明顯升 高（P＜0.05），而8 Gy X射 線 照 射 后shATRX1-HeLa組G0/G1期細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.05）、G2/M期細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2和圖1。

2.3 各組HeLa細(xì)胞凋亡率與shCon-HeLa組比較，0、2和8 Gy X射線照射后shATRX1-HeLa組細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），且凋亡率隨著照射劑量增加而升高。見(jiàn)表2和圖2。

表2 不同劑量X射線照射后24 h各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率和凋亡率Tab.2Percentages of cells in different cell cycles and apoptotic rates in various groups at 24 h after different doses of X-ray irradiation (n=4，±s，η/%）

表2 不同劑量X射線照射后24 h各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率和凋亡率Tab.2Percentages of cells in different cell cycles and apoptotic rates in various groups at 24 h after different doses of X-ray irradiation (n=4，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with shCon-HeLa group.

Group shCon-HeLa 0 Gy 2 Gy 8 Gy shATRX1-HeLa 0 Gy 2 Gy 8 Gy Percentage of cells G0/G1 60.32±3.47 69.12±0.93 19.48±0.47 57.60±0.42 62.01±0.72*36.25±2.29*S 28.81±3.11 23.61±2.06 18.29±1.29 29.51±0.16 26.91±1.89 17.83±0.39 G2/M 9.54±1.20 7.28±1.14 62.23±0.83 12.89±0.26*11.09±1.59*45.82±1.90*Apoptotic rate 5.51±1.22 6.53±0.37 8.15±0.23 10.17±1.34*13.43±1.63*15.84±1.23**

2.4 各組HeLa細(xì)胞中PARP1、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量與shCon-HeLa組比較，2和8 Gy X射線照射后24和48 h，shATRX1-HeLa組細(xì)胞中 PARP1、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)量均增加，與細(xì)胞凋亡率變化規(guī)律一致。見(jiàn)圖3。

3 討 論

世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）發(fā)布2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，中國(guó)新發(fā)癌癥患者數(shù)位居全球第一，占全球的23.7%，腫瘤嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。宮頸癌是女性惡性腫瘤死亡的第二大原因，是全球第四位常見(jiàn)的女性腫瘤［8］。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展涉及到多種因素，放療是常規(guī)的治療手段，但由于腫瘤周?chē)＝M織的放射損傷和某些腫瘤的輻射耐受問(wèn)題使放療的應(yīng)用受到限制。研究者［9］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了輻射固有抗性的來(lái)源，如缺氧、致癌基因和細(xì)胞信號(hào)通路的激活、細(xì)胞凋亡缺陷和DNA損傷修復(fù)等。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí)，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)將被激活，細(xì)胞會(huì)通過(guò)細(xì)胞周期蛋白（cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinase，CDK）共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，細(xì)胞將被阻滯在某個(gè)細(xì)胞周期，為DNA損傷的修復(fù)贏取時(shí)間［10］。給予大劑量X射線輻射后，DNA出現(xiàn)鏈斷裂，其中雙鏈斷裂是非常嚴(yán)重的損傷，迫使腫瘤細(xì)胞死亡。本研究結(jié)果顯示：HeLa細(xì)胞經(jīng)2和8 Gy X射線照射后，出現(xiàn)不同的細(xì)胞周期阻滯，2 Gy X射線照射導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，而8 Gy X射線照射則導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，存在劑量的差異。研究［1-2］表明：DNA損傷輕微時(shí)，細(xì)胞傾向于G1期修復(fù)，主要以NHEJ方式，而損傷嚴(yán)重時(shí)，則啟動(dòng)G2/M期阻滯，有利于自身存活，主要以HR方式。本研究結(jié)果表明：輻射后腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出的阻滯為DNA損傷修復(fù)贏得時(shí)間，修復(fù)不能完成細(xì)胞則死亡，也為以調(diào)控周期為靶點(diǎn)的腫瘤基因放療提供了新的思路。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同劑量X射線照射后24 h各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率Fig.1Percentages of cells at different cell cycles at 24 h after different doses of X-ray irradiation detected by flow cytometry in various groups

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同劑量X射線照射后24 h各組細(xì)胞凋亡率Fig.2Apoptotic rates of cells at 24 h after different doses of X-ray irradiation detected by flow cytometry in various groups

圖3 Western blotting法檢測(cè)不同劑量X射線照射后各組細(xì)胞中PARP1、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of PARP1,cleaved caspase-9,and cleaved caspase-3 proteins after different doses of X-ray irradiation detected by Western blotting method in various groups

ATRX屬于SWI/SNF2家族成員，其在核內(nèi)的定位和磷酸化與細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān)［11］。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果［12-14］顯示：在細(xì)胞各周期階段ATRX富集在細(xì)胞核，細(xì)胞分裂期間在著絲粒、端粒和X染色體上富集。本研究結(jié)果顯示：靶向沉默ATRX后，0和2 Gy X射線誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分率明顯降低，而G2/M期細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.05）；8 Gy X射線照射后，G0/G1期細(xì)胞百分率明顯升高，G2/M期細(xì)胞百分率明顯降低。本研究結(jié)果表明：ATRX沉默后，HeLa細(xì)胞的輻射損傷修復(fù)能力明顯降低。JUHáSZ等［15］報(bào)道：在HR過(guò)程中ATRX能夠促進(jìn)DNA的修復(fù)合成和姐妹染色單體的互換。另外，KOSCHMANN等［16］發(fā)現(xiàn)：當(dāng)ATRX缺失時(shí)，可以損傷膠質(zhì)瘤的NHEJ。由此可見(jiàn)，ATRX沉默后，HeLa細(xì)胞的輻射損傷修復(fù)能力降低，損傷加重，本課題組之前的研究［6］也證實(shí)了這一點(diǎn)。

細(xì)胞周期阻滯后，激活DNA損傷效應(yīng)（DNA damage response，DDR），如果細(xì)胞未被修復(fù)，則誘發(fā)細(xì)胞凋亡。研究［17-18］表明：細(xì)胞凋亡主要有3條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括死亡受體途徑、線粒體途徑和p53依賴的途徑。DNA嚴(yán)重?fù)p傷后，細(xì)胞激活一系列通路，如p53/p21通路活性致細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，如未能修復(fù)則誘導(dǎo)凋亡［19-21］。PARP是一種DNA損傷感受器，通過(guò)組蛋白的ADP-核糖基化使組蛋白脫離，從而完成DNA修復(fù)。PARP還是凋亡效應(yīng)子caspase-3的酶切位點(diǎn)，DNA損傷時(shí)，PARP可以過(guò)度激活導(dǎo)致caspase-3的激活和PARP斷裂而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示：2和8 Gy X射線照射后HeLa細(xì)胞凋亡率明顯升高，而靶向沉默ATRX后輻射誘導(dǎo)的凋亡率升高更明顯；凋亡相關(guān)蛋白PARP1表達(dá)量的變化與細(xì)胞凋亡率變化規(guī)律相似，且caspase-9和caspase-3蛋白被切割成有活性的剪切體（cleaved caspase-9和cleaved caspase-3）；輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加后，細(xì)胞也顯示出增殖抑制作用，而且靶向沉默ATRX后，細(xì)胞增殖抑制效果更明顯。

綜上所述，靶向沉默ATRX后輻射誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞G2/M期阻滯降低，而G0/G1期細(xì)胞百分率升高，修復(fù)能力降低，增強(qiáng)了輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增強(qiáng)了輻射殺傷細(xì)胞的作用，有利于放射治療，ATRX有望成為腫瘤放療增敏的分子靶點(diǎn)。