人參皂苷Rh1對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖和分化的促進(jìn)作用及其機(jī)制

毛天嬌,孫 鐸,高 幸,魏 溦,李熙恒,姜可新,姜 秋，李 江,3

（1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院兒童口腔科，吉林 長(zhǎng)春130021；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，廣東 廣州510150）

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的與衰老相關(guān)的疾病，尤其高發(fā)于絕經(jīng)后婦女，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量［1］，除導(dǎo)致股骨和髖骨等長(zhǎng)骨的脆性骨折外，也會(huì)導(dǎo)致頜骨密度和牙槽骨高度降低，從而加速牙齒的脫落，并影響義齒修復(fù)、種植體植入和頜面部整形手術(shù)等口腔治療［2］。隨著全球人口老齡化進(jìn)程的加劇，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率呈逐年升高的態(tài)勢(shì)［3］，治療骨質(zhì)疏松癥的高成本給社會(huì)和個(gè)人都帶來了巨大的壓力，是目前全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生醫(yī)療挑戰(zhàn)［4］。長(zhǎng)期以來中藥一直用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥，與化學(xué)合成藥物比較，中藥不良反應(yīng)少，更適合長(zhǎng)期使用，因此在國內(nèi)外受到廣泛關(guān)注和研究。人參廣泛用于預(yù)防和治療各種疾病［5］，人參皂苷是人參的主要活性成分，已有研究［6-7］表明：人參皂苷Rb1和Rg3具有治療骨質(zhì)疏松的作用，但其作用機(jī)制尚不清楚。雌激素受體（estrogen receptor，ER）廣泛存在于骨組織中，雌激素受體β（estrogen receptorβ，ERβ）是其主要表達(dá)形式［8］。本研究以ERβ為靶點(diǎn)，篩選出可以靶向上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ERβ轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的人參皂苷單體，并進(jìn)一步探討其對(duì)MC3T 3-E1細(xì)胞增殖和分化的影響，為人參皂苷治療骨質(zhì)疏松癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人胚腎上皮細(xì)胞系HEK 293T和小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T 3-E1購自美國組織培養(yǎng)庫（American Tissue Culture Colection，ATCC細(xì)胞庫。PGL 2-ERβ質(zhì)粒由東北師范大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶和青-鏈霉素等試劑（美國Gibco公司），人參皂苷單體（Rb1、Rb2、Rd、Rg1、Rg2和Rh1）和雌二醇（estradiol，E2）（寶雞辰光科技有限公司），內(nèi)參β-actin、兔抗ERβ和HRP標(biāo)記二抗（英國Abcam公司），β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸（美國Sigma公司），RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒、CCK-8試劑盒、4%多聚甲醛、BCIP/NBT堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP）顯色試劑盒和茜素紅S（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），Vanox倒置顯微鏡（日本Olympus公司），酶標(biāo)儀（美國Bio-TEK公司），電泳儀（美國賽默飛世爾公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)自液氮中取出凍存的293T細(xì)胞和MC3T 3-E1細(xì)胞復(fù)蘇，采用含10%胎牛血清和1%青霉素及鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～5 d傳代1次，傳3代后，待細(xì)胞活力恢復(fù)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)HEK293T細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性為篩選能夠激活ERβ啟動(dòng)子的人參皂苷單體，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK 293T細(xì)胞，按每孔8×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于48孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%融合后，轉(zhuǎn)染PGL 2-ERβ和內(nèi)參Renilla熒光素酶質(zhì)粒Prep7-Rluc至HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染16 h后，細(xì)胞分為對(duì)照組、雌二醇組和人參皂苷組，分別用PBS緩沖液，雌二醇（1×10－6mmol·L－1）和 人 參 皂 苷Rb1、Rb2、Rd、Rg1、Rg2、Rh1（1×10－5mmol·L－1）分別處理細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，給藥24 h后，檢測(cè)并計(jì)算雙熒光素酶報(bào)告基因活性，代表ERβ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲熒光強(qiáng)度/內(nèi)參海腎熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western blotting法檢測(cè)各組MC3T 3-E1細(xì)胞中ERβ蛋白表達(dá)水平MC3T 3-E1細(xì)胞分為對(duì)照組、雌二醇組和不同濃度（1×10－6、1×10－5和1×10－4mmol·L－1）人參皂苷Rh1組，分別用PBS緩沖液、雌二醇（1×10－6mmol·L－1）和不同濃度人參皂苷Rh1處理各組細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，使用預(yù)冷過的PBS緩沖液洗滌后，加入適量RIPA裂解液，置于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r·min－1離心15 min，收集上清，用BCA法檢測(cè)并定量總蛋白濃度。取20μg各組蛋白進(jìn)行上樣，行SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，加入ERβ抗體（1∶400）和β-actin抗體（1∶1 000），4℃條件下孵育過夜。次日，1×TBST洗滌3次，每次5 min，隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，于室溫下孵育1 h，1×TBST洗滌3次，每次10 min，加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑ECL進(jìn)行顯影。ERβ蛋白表達(dá)水平=ERβ蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Auto Dock分子結(jié)構(gòu)對(duì)接準(zhǔn)備配體文件，從美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上下載的Rh1小分子配體文件進(jìn)行保存，采用SDF格式。通過Py MOL 3D分子視圖軟件和PMV-1.5.6軟件，對(duì)該分子進(jìn)行初始化并將處理后的配體文件輸出，其格式為pdbqt。然后準(zhǔn)備大分子受體蛋白質(zhì)文件，ERβ大分子受體蛋白文件需要從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中下載，保存為pdb格式，把大分子受體蛋白去掉H2O分子并添加H原子，保存后將其輸出至pdbqt格式文件。運(yùn)行Auto Grid4和Auto Dock4，在PMV-1.5.6軟件中將處理后的大小分子完整放置于Grid格子中，設(shè)置合理的格子把Auto Grid參數(shù)保存成GPF文件。選擇上述得到的小分子配體文件、大分子配體文件和Auto Grid參數(shù)；在PMV-1.5.6軟件中載入之前準(zhǔn)備好的小分子和大分子pdbqt文件，并進(jìn)行相關(guān)文件的設(shè)置，在對(duì)接運(yùn)行參數(shù)后，采用馬克遺傳算法運(yùn)行程序并生成dlg格式文件。最后，在PMV-1.5.6軟件中打開文件，日志中的對(duì)接結(jié)果分子構(gòu)象為10個(gè)，并將相關(guān)數(shù)據(jù)顯示出來，載入大分子，分析對(duì)接情況。

1.6 CCK-8法檢測(cè)MC3T 3-E1細(xì)胞增殖率實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、雌二醇組（1×10－6mmol·L－1）和不同 濃 度（5×10－6、1×10－5、5×10－5、1×10－4、1×10－3和5×10－3mmol·L－1）人參 皂 苷Rh1組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MC3T 3-E1細(xì)胞，按每孔8×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)分組給予藥物，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入100μL不含血清的DMEM培養(yǎng)基和10μL CCK-8，繼續(xù)孵育3 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率＝實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)MC3T 3-E1細(xì)胞分為對(duì)照組、雌 二 醇 組（1×10－6mmol·L－1）和 不 同 濃 度（1×10－5及1×10－4mmol·L－1）人參皂苷Rh1組。將狀態(tài)良好的MC3T 3-E1細(xì)胞接種于6孔板，用含10%胎牛血清和1%青霉素及鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（10 mmol·L－1β-甘油磷酸鈉，50 mg·L－1抗壞血酸，含10%胎牛血清的DMEM），每隔1 d更換1次成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求分別誘導(dǎo)7、14和21 d。

1.8 偶氮偶聯(lián)法ALP染色細(xì)胞分組同“1.7”，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MC3T 3-E1細(xì)胞按每孔3×105的密度接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，更換為含有不同濃度藥物的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3 d更換1次成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別誘導(dǎo)7和14 d。誘導(dǎo)完成后，使用PBS緩沖液清洗，4%多聚甲醛固定后，在室溫避光條件下，按照說明書的步驟，配制BCIP/NBT工作液進(jìn)行ALP染色，反應(yīng)中止后在顯微鏡下觀察ALP染色面積，ALP染色陽性可見細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)紫色，并且有藍(lán)紫色顆粒物。

1.9 茜素紅染色觀察細(xì)胞中鈣化結(jié)節(jié)面積細(xì)胞分組同“1.7”，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MC3T 3-E1細(xì)胞按每孔3×105的密度接種于6孔板后置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，更換為含有不同濃度藥物的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3 d更換1次成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)21 d后，使用PBS緩沖液清洗，4%多聚甲醛固定后，在室溫避光條件下，按照說明書的步驟，用1%濃度的茜素紅染液進(jìn)行染色，反應(yīng)終止后觀察鈣結(jié)節(jié)染色結(jié)果及面積，礦化結(jié)節(jié)呈紅色斑點(diǎn)狀。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組293T細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性、MC3T 3-E1細(xì)胞中ERβ蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞增殖率均以±s表示，多組間樣本平均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組HEK 293T細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，人參皂苷Rb1和人參皂苷Rh1組HEK 293T細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），且人參皂苷Rh1組HEK293T細(xì)胞相對(duì)熒光酶活性最高，表明人參皂苷Rh1組HEK 293T細(xì)胞中ERβ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性明顯上調(diào)。見圖1。

圖1 各組HEK 293T細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性Fig.1Activities of luciferase in HEK 293T cells in various groups

2.2 各組MC3T 3-E1細(xì)胞中ERβ蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，人參皂苷Rh1組和雌二醇組MC3T 3-E1細(xì)胞中ERβ蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），且人參皂苷Rh1具有濃度依賴性，濃度為1×10－4mmol·L－1時(shí)，細(xì)胞中ERβ蛋白表達(dá)水平最高。見圖2。

圖2 各組MC3T 3-E1細(xì)胞中ERβ蛋白表達(dá)電泳圖(A)和直條圖(B)Fig.2Electrophoregram(A)andhistogram(B)of expressions of ERβprotein in MC3T 3-E1 cells in various groups

2.3 人參皂苷Rh1與ERβ分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)通過Auto Dock計(jì)算模擬人參皂苷Rh1與ERβ的分子對(duì)接，結(jié)果顯示：人參皂苷Rh1可結(jié)合在ERβ的配體結(jié)合口袋內(nèi)。有7個(gè)氨基酸對(duì)接位點(diǎn)：GLU-291、GLY-367、 LYS-368、 VAL-370、 GLU-371、GLY-372和LEU-374。見圖3。

圖3 人參皂苷Rh1與ERβ對(duì)接位點(diǎn)Fig.3Docking sites of ginsenoside Rh1 and ERβ

2.4 各組MC3T 3-E1細(xì)胞增殖率不同濃度人參皂苷Rh1和雌二醇與MC3T 3-E1細(xì)胞共培養(yǎng)24、48和72 h后，與對(duì)照組比較，1×10－5、5×10－5、1×10－4和1×10－3mmol·L－1人參皂苷Rh1組及雌二醇組MC3T 3-E1細(xì)胞增殖率明顯升高（P＜0.01），且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖率明顯升高，72 h時(shí)1×10－4mmol·L－1人參皂苷Rh1組細(xì)胞增殖率最高。見表1。

表1 各組MC3T 3-E1細(xì)胞增殖率Tab.1Proliferation rates of MC3T 3-E1 cells in various groups (n=5,±s，η/%)

表1 各組MC3T 3-E1細(xì)胞增殖率Tab.1Proliferation rates of MC3T 3-E1 cells in various groups (n=5,±s，η/%)

*P＜0.01 compared with control group.

Group Control Ginsenoside Rh1(mmol·L－1)5×10－6 1×10－5 5×10－5 1×10－4 1×10－3 5×10－3 Estrodiol Proliferation rate(t/h) 24 100.000±0.116 103.579±0.072 108.301±0.071*110.159±0.078*117.323±0.067*107.158±0.068*103.107±0.103 109.663±0.071*48 100.000±0.011 103.954±0.013 108.302±0.012*112.582±0.009*120.016±0.011*109.711±0.013*103.292±0.015 110.770±0.009*72 100.000±0.013 104.952±0.021 109.731±0.023*113.025±0.023*122.282±0.021*107.632±0.019*102.107±0.014 111.819±0.009*

2.5 各組MC3T 3-E1細(xì)胞ALP染色結(jié)果MC3T 3-E1細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化7和14 d后，與對(duì)照組比較，不同濃度人參皂苷Rh1組MC3T 3-E1細(xì)胞中可見大量散在胞質(zhì)內(nèi)的藍(lán)紫色顆粒，細(xì)胞ALP染色呈陽性，1×10－4mmol·L－1人參皂苷Rh1組細(xì)胞ALP染色面積最大，且14 d時(shí)ALP染色面積較7 d時(shí)明顯增加。見圖4。

2.6 各組MC3T 3-E1細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色結(jié)果成骨誘導(dǎo)分化21 d后，各組MC3T 3-E1細(xì)胞中均有紅染鈣化結(jié)節(jié)，與對(duì)照組比較，不同濃度人參皂苷Rh1組MC3T 3-E1細(xì)胞中紅色鈣化結(jié)節(jié)面積明顯增加，1×10－4mmol·L－1人參皂苷Rh1組鈣化結(jié)節(jié)面積最大，與雌二醇組接近。見圖5。

圖4 各組MC3T 3-E1細(xì)胞成骨分化過程中ALP染色(Bar=500μm)Fig.4Results of ALP staining of MC3T 3-E1 cells during osteogenic differentiation in various groups(Bar=500μm)

圖5 各組MC3T 3-E1細(xì)胞成骨分化過程中骨基質(zhì)的鈣化（茜素紅）Fig.5Calcification of bone matrix during osteogenic differentiation of MC3T 3-E1 cells in various groups(Alizarin red)

3 討 論

隨著年齡的增長(zhǎng)，骨量的減少和成骨能力的降低會(huì)影響頜面外科手術(shù)和種植牙的效果［9］。有研究［10］表明：治療骨質(zhì)疏松癥的藥物可以有效改善牙槽骨的丟失，并促進(jìn)種植體周圍的骨整合。目前，臨床上常用的雙膦酸鹽、雌激素替代療法和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等雖然可以在一定程度上改善骨質(zhì)疏松癥，但長(zhǎng)期使用都會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)［11-12］。如何阻止骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展一直是研究的熱點(diǎn)。

來自中藥的天然產(chǎn)物是開發(fā)新藥的優(yōu)秀且可靠的來源。人參皂苷是人參、西洋參和三七中的主要有效成分，可溶于無水乙醇和DMSO，不溶于水，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗骨質(zhì)疏松等多種藥理活性［13-14］；人參皂苷與內(nèi)源性雌激素結(jié)構(gòu)相似，可以作為ER的選擇性配體［14］。ER在協(xié)調(diào)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在骨穩(wěn)態(tài)中的活性以及預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)流失中起重要作用。是潛在的治療骨質(zhì)疏松的靶標(biāo)［15］。研究［16-17］顯示：ERβ參與了骨代謝，在成骨細(xì)胞分化過程中處于高表達(dá)水平。因此本研究以ERβ作為靶點(diǎn)，篩選出可以靶向上調(diào)ERβ轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的人參皂苷Rh1，并利用Auto Dock分子作用力分析軟件3D模擬人參皂苷Rh1與ERβ的結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)了人參皂苷Rh1可以與ERβ蛋白發(fā)生分子結(jié)構(gòu)對(duì)接，表明人參皂苷Rh1可以與成骨細(xì)胞內(nèi)的ERβ基因序列啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，從而上調(diào)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，起到了與內(nèi)源性雌激素類似的作用。

本研究進(jìn)一步探討人參皂苷Rh1對(duì)MC3T 3-E1細(xì)胞增殖和分化的作用，結(jié)果表明：在一定濃度范圍內(nèi)，人參皂苷Rh1可以呈濃度依賴性促進(jìn)MC3T 3-E1細(xì)胞增殖。成骨細(xì)胞的分化和基質(zhì)鈣化是骨形成的基礎(chǔ)，ALP是骨形成時(shí)期活躍分泌的蛋白，可以啟動(dòng)成骨細(xì)胞的鈣化，是常用的評(píng)估成骨細(xì)胞早期分化的指標(biāo)［18-20］。本研究結(jié)果顯示：人參皂苷Rh1可以明顯增強(qiáng)MC3T 3-E1細(xì)胞中ALP活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的早期分化。茜素紅染色是測(cè)定成骨細(xì)胞基質(zhì)鈣化的特異性指標(biāo)，本研究結(jié)果表明：人參皂苷Rh1可以明顯促進(jìn)MC3T 3-E1細(xì)胞基質(zhì)中鈣化結(jié)節(jié)的形成。

綜上所述，人參皂苷Rh1可以與MC3T 3-E1細(xì)胞中的ERβ靶向結(jié)合，從而上調(diào)細(xì)胞中ERβ的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。本研究結(jié)果為人參皂苷Rh1用于骨質(zhì)疏松癥的防治提供了依據(jù)。