雌二醇聯(lián)合1，25-二羥維生素D3對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠的治療作用

李希寧,翁 偉,沈哲源,豆曉杰,閔繼康

（1.湖州師范學院醫(yī)學院病理學教研室，浙江 湖州313000；2.湖州師范學院附屬第一醫(yī)院骨科，浙江 湖州313000）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種常見的代謝性骨疾病，是絕經(jīng)后女性卵巢功能減退及雌激素水平下降導致，雌激素通過影響骨細胞的活性進而導致骨密度降低［1］。在絕經(jīng)后女性中，雌激素水平降低可促進破骨細胞分化，誘導骨細胞凋亡，并抑制成骨細胞分化功能［2-3］。臨床常用激素替代療法來治療PMOP，但單純口服雌二醇效果有限，用量過大容易產(chǎn)生如腫瘤、肥胖和消化系統(tǒng)癥狀等不良反應［4］。維生素D是一種微量營養(yǎng)素，可代謝為多功能類固醇激素，在體內(nèi)具有廣泛的生物學功能［5］?；钚跃S生素D3在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為1，25-二羥基維生素D3［1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25（OH）2D3］，1，25（OH）2D3可誘導鈣蛋白合成，促進小腸對鈣離子的吸收，促進鈣鹽的更新及新骨生成，也可促進磷吸收及腎小管細胞對鈣和磷的重吸收，進而提高血鈣和血磷水平，有利于新骨生成和鈣化［6-7］。臨床上骨質(zhì)疏松癥治療的目的是改善骨的負性重塑平衡，因此使骨代謝平衡變?yōu)檎灾陵P重要［8］，建議患者在服用治療骨質(zhì)疏松的藥物時補充活性維生素D3［9］，但其具體機制有待進一步研究。本研究通過復制大鼠PMOP模型，對比單純應用雌二醇和雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3對大鼠血清生化指標和骨組織的影響，為臨床預防和治療PMOP提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器40只SD雌性大鼠購于上海杰思捷實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0004，飼養(yǎng)于浙江省湖州市食品藥品檢驗研究院SPF級動物房。苯甲酸雌二醇注射液（廣州白云山制藥股份有限公司），1，25（OH）2D3（美國Sigma公司），堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OC）、骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、Ⅰ型前膠原氨基端原肽（procollagen type i n-terminal propeptide，PINP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRACP）和核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）抗體（美 國Abcam公司），逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）試劑盒（美國ThermoFisher公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。雙能X射線骨密度儀（韓國Osteosys公司），三點力學生物儀（上海能共實業(yè)有限公司），倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本Olympus公司），PCR儀（美國ThermoFisher公司），凝膠電泳儀和成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 實驗動物分組和模型建立40只雌性SD大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為對照組（10只）和手術組（30只）。手術組大鼠用10%水合氯醛0.3 mL·100 g－1腹腔注射麻醉，打開腹腔，摘除雙側(cè)卵巢，術后每只大鼠立即肌注青霉素50 000 U，每天肌注1次，持續(xù)3 d。術后喂養(yǎng)1周，將手術組大鼠隨機分為模型組、雌二醇組和雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3組，每組10只。雌二醇組大鼠每周肌肉注射苯甲酸雌二醇0.05 mg·kg－13次；雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3組大鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇的同時每天腹腔注射1，25（OH）2D31μg·kg－1。連續(xù)喂養(yǎng)24周，實驗期間大鼠自由進食和進水。

1.3 大鼠血清學檢測和骨組織形態(tài)表現(xiàn)觀察實驗結束后，乙醚麻醉大鼠，采血、分離血清，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，全自動生化分析儀檢測大鼠血清中ALP、OC、OPG、PINP、TRACP和RANKL水平。取大鼠左側(cè)股骨用4%多聚甲醛溶液固定，EDTA脫鈣液脫鈣，以長針可刺入為準。流水過夜沖洗，定量濃度乙醇浸泡，石蠟包埋，切片，HE染色和TRACP染色，光鏡下觀察大鼠骨組織形態(tài)表現(xiàn)。

1.4 大鼠股骨骨密度（bone mineral density，BMD）檢測和生物力學分析實驗結束后取大鼠右側(cè)股骨，采用雙能X射線骨密度儀檢測大鼠整只股骨BMD。BMD檢測結束后，采用CTM 2050S萬能拉力試驗機，取大鼠右側(cè)股骨全長，放入室溫下的生理鹽水當中浸泡3 h，取出恢復室溫，兩端用黏膠澆鑄后放在間距為22 mm三點壓縮實驗臺上，標本橫截面短軸的方向與加速度方向一致，最大加載速度為2 mm·min－1，啟動壓力架開關，待股骨斷裂后計算機得出各生物力學數(shù)據(jù)，包括骨組織彈性模量（elastic modulus）、剛度（stiffness）、最大應力（maximum stress）和最大承受力（maximum lord）。

1.5 采用RT-PCR法和Western blotting法檢測大鼠骨組織中骨代謝指標m RNA和蛋白表達水平實驗結束后取大鼠雙側(cè)脛骨，剝離肌肉和骨膜后快速置于液氮中冷凍60 min取出，置于研缽中磨碎。一側(cè)脛骨加入TRIzol提取總RNA，并用Nano-Drop分光光度計測定RNA含量。按照High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit和Power SYBR?Green PCR Master Mix說明書合成cDNA并進行PCR擴增。采用StepOnePlus System software導出循環(huán)值（Ct），采用相對定量2－△△Ct法計算目的基因mRNA表達水平。引物序列見表1。

表1 ALP、OC、OPG和RANKL引物序列Tab.1Primer sequences of ALP,OC,OPG and RANKL

一側(cè)脛骨磨碎后加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳后轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h后，加入一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育1 h，增強化學發(fā)光法（enhanced chamilium-inescence，ECL）顯影，應用Gel Image System-1600凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并進行定量分析，計算目的蛋白表達水平，目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組大鼠血清中ALP、OC、OPG、PINP、TRACP和RANKL水平，各組大鼠股骨BMD、彈性模量、剛度、最大應力和最大承受力，各組大鼠骨組織中ALP、OC、OPG和RANKL mRNA及蛋白表達水平，均符合正態(tài)分布且方差齊，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清中成骨和破骨相關指標水平

與對照組比較，模型組大鼠血清中ALP、OC、OPG、PINP、TRACP和RANKL水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，雌二醇組大鼠血清中ALP、OC、OPG、PINP、TRACP和RANKL水平明顯降低（P＜0.01），雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3組大鼠血清中ALP、PINP、TRACP和RANKL水平明顯降低（P＜0.01）且OPG/RANKL比值明顯升高（P＜0.01）；與雌二醇組比較，雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3組大鼠血清中OC和OPG水平及OPG/RANKL比值明顯升高（P＜0.01），TRACP和RANKL水平明顯降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清中成骨和破骨相關指標水平Tab.2Levels of osteogenesis-and osteoclast-related indexes in serum of rats in various groups (n=6，±s）

表2 各組大鼠血清中成骨和破骨相關指標水平Tab.2Levels of osteogenesis-and osteoclast-related indexes in serum of rats in various groups (n=6，±s）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs model group；＃P＜0.01 vs estradiol group.

Group Control Model Estradiol Estradiol combined with 1,25(OH)2D 3 ALP[λB/(U·L－1)]88.865±2.895 127.161±8.473*90.680±12.223△96.316±13.252△OC[ρB/(μg·L－1)]1.179±0.177 4.909±0.643*2.919±0.253△4.157±0.216＃OPG[ρB/(μg·L－1)]8.657±1.239 14.093±1.329*9.916±1.080△14.526±1.610＃PINP[ρB/(μg·L－1)]12.290±0.801 19.803±1.554*12.610±1.724△11.372±1.769△TRACP[λB/(U·L－1)]15.236±0.960 31.363±2.441*17.828±1.683△8.063±2.054△＃RANKL[ρB/(μg·L－1)]1.552±0.191 3.488±0.494*1.730±0.580△0.819±0.184△＃OPG/RANKL 5.663±1.273 4.133±0.899 6.005±2.044 18.226±3.414△＃

2.2 各組大鼠骨組織形態(tài)表現(xiàn)HE染色光鏡下觀察：對照組大鼠股骨骨外膜以纖維和成纖維細胞為主，骨膜厚度均勻；模型組大鼠骨膜厚度明顯增加，破骨細胞數(shù)量增多且骨外膜下可見少許點狀蟲蝕狀缺損，呈現(xiàn)典型骨質(zhì)疏松癥特點；雌二醇組大鼠骨膜厚度較模型組明顯變薄，成骨與破骨細胞數(shù)量接近正常，骨組織形態(tài)特點接近正常骨組織；雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3組大鼠骨外膜填充著活躍的成骨細胞，其厚度明顯增加，骨膜下無蟲蝕狀缺損，與對照組比較骨組織無明顯變化（圖1）。TRACP染色光鏡下觀察：對照組大鼠只有極少量功能活躍破骨細胞；模型組大鼠骨外膜下破骨細胞數(shù)量增多并且功能活躍；雌二醇組大鼠后骨外膜下破骨細胞數(shù)量較模型組減少，無蟲蝕狀缺損；雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3組大鼠骨外膜破骨細胞數(shù)量進一步減少，成骨細胞數(shù)量增多。見圖2。

圖1 HE染色觀察各組大鼠骨組織形態(tài)表現(xiàn)（×200）Fig.1Morphology of bone tissue of rats in various groups observed by HE staining(×200)

圖2 TRACP染色觀察各組大鼠骨組織形態(tài)表現(xiàn)（×200）Fig.2Morphology of bone tissue of rats in various groups observed by TRACP staining(×200)

2.3 各組大鼠股骨BMD和生物力學指標與對照組比較，模型組大鼠股骨BMD、彈性模量、剛度、最大應力和最大承受力均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，雌二醇組和雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3組大鼠大鼠股骨上述指標明顯升高（P＜0.01）；與雌二醇組比較，雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3組大鼠股骨BMD、彈性模量和最大應力明顯升高（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠股骨BMD和生物力學指標Tab.3Femoral BMD and biomechanical indexes of rats in various groups (n=5，±s）

表3 各組大鼠股骨BMD和生物力學指標Tab.3Femoral BMD and biomechanical indexes of rats in various groups (n=5，±s）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs model group；＃P＜0.01 vs estradiol group.

Group Control Model Estradiol Estradiol combined with 1,25(OH)2D 3 BMD(mg·cm－2)123.645±10.167 67.092±5.110*97.870±5.557△132.234±11.911△＃Elastic modulus(P/Mpa)635.809±64.746 337.594±60.210*493.003±65.654△670.116±87.066△＃Stiffness(N·mm－1)872.072±38.823 612.921±106.258*813.682±22.937△856.421±42.933△Maximum stress(N·mm－2)21.131±1.535 9.138±1.723*15.624±3.054△20.524±1.707△＃Maximum lord(F/N)103.778±4.979 48.453±7.721*96.192±4.170△99.825±8.595△

2.4 各組大鼠骨組織中成骨和破骨相關指標mRNA和蛋白表達水平與對照組比較，模型組大鼠骨組織中ALP、OC、OPG及RANKL mRNA和蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，雌二醇組大鼠骨組織中ALP、OC、OPG及RANKL mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.01），雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3組大鼠骨組織中ALP、OC和RANKL mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.01）；與雌二醇組比較，雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3組大鼠骨組織中ALP及OC mRNA和蛋白表達水平無明顯變化（P＞0.05），OPG mRNA和蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），RANKL mRNA和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。見表4、圖3和圖4。

表4 各組大鼠骨組織中成骨和破骨相關指標mRNA表達水平T ab.4Expression levels of mRNA of osteogenesis-and osteoclast-related indexes in bone tissue of rats in various groups(n=3，±s）

表4 各組大鼠骨組織中成骨和破骨相關指標mRNA表達水平T ab.4Expression levels of mRNA of osteogenesis-and osteoclast-related indexes in bone tissue of rats in various groups(n=3，±s）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs model group；＃P＜0.01 vs estradiol group.

Group Control Model Estradiol Estradiol combined with 1,25(OH)2D 3 ALP 1 1.551±0.173*1.041±0.102△1.060±0.279△OC 1 2.806±0.647*1.543±0.371△1.622±0.615△OPG 1 3.148±0.061*1.340±0.307△3.479±0.618＃RANKL 1 2.598±0.407*1.085±0.160△0.390±0.223△＃

圖3 各組大鼠骨組織中成骨和破骨相關指標蛋白表達電泳圖Fig.3Electrophoregram of expressions of osteogenesisand osteoclast-related index proteins in bone tissue of rats in various groups

3 討 論

骨組織在體內(nèi)具有新陳代謝特點，表現(xiàn)為破骨細胞吸收舊骨、成骨細胞生成等量新骨取代以完成骨轉(zhuǎn)換［10］。雌激素缺乏是引起PMOP的主要原因之一，雌激素能促進早期成骨細胞分化，刺激膠原蛋白并抑制破骨細胞活性［11］。絕經(jīng)后女性雌激素嚴重不足，成骨細胞功能減弱而破骨細胞活性增加，BMD降低，增加骨轉(zhuǎn)化率，影響鈣鹽沉積，使骨消融增加，大量骨質(zhì)丟失，最終導致各類骨折的發(fā)生［12-13］。臨床上常以激素替代（雌二醇）療法治療PMOP，但由于劑量依賴性常導致比較嚴重不良反應發(fā)生。因此，如何增強雌二醇調(diào)節(jié)PMOP中骨平衡功能，促進成骨細胞增殖和分化，并減少雌二醇用藥劑量是亟需解決的問題。

維生素D是一種脂溶性維生素，也被看作是一種作用于鈣、磷代謝的激素前體，通過體內(nèi)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)變成有活性的1，25（OH）2D3。在1，25（OH）2D3不足或缺乏的情況下，腸道鈣吸收減少，導致血清鈣細微減少，引起甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）分泌增加［14］。持續(xù)升高的PTH不僅能增強維生素骨化三醇的活性，而且還能促進骨吸收［15］。因此，在1，25（OH）2D3不足或缺乏的情況下，骨重塑平衡變成負值［16］。研究［17］表明：1，25（OH）2D3可誘導破骨細胞形成，并發(fā)揮骨吸收活性，但1，25（OH）2D3對PMOP中成骨細胞的作用尚未見詳細報道，尤其是其與雌激素的聯(lián)合作用。本研究結果顯示：與雌二醇組比較，雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3治療后可明顯促進大鼠骨組織中成骨細胞增殖，增加骨膜厚度，增強骨形成過程，同時抑制破骨細胞數(shù)量從而減弱絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中的骨轉(zhuǎn)換加速。在骨轉(zhuǎn)換過程中，骨代謝生化指標發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［18］。臨床專家共識中常用骨形成指標包括ALP、OC、PINP和OPG等，骨吸收指標包括TRACP、RANKL、Ⅰ型膠原C端肽（CTX）和I型膠原N端肽（NTX）等［19-20］。本研究結果顯示：與雌二醇組比較，雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3組大鼠血清中代表骨形成的OC和OPG水平明顯升高，代表骨吸收的TRACP和RANKL水平明顯降低，說明1，25（OH）2D3能夠明顯增強大鼠體內(nèi)成骨細胞功能，增強成骨活性，明顯促進骨形成的同時明顯抑制骨吸收。臨床上將BMD低于絕經(jīng)前女性絕對值2.5個或以上標準差作為骨質(zhì)疏松癥的診斷標準［21］。本研究通過進一步生物力學分析顯示：雌二醇和1，25（OH）2D3聯(lián)合用藥比單純雌二醇治療能更好地增加PMOP大鼠的BMD，并增強骨組織承受能力，從而緩解骨質(zhì)疏松進展。

圖4 各組大鼠骨組織中成骨和破骨相關指標蛋白表達水平Fig.4Expression levelsof osteogenesis-and osteoclast-related index proteinsin bonetissueof ratsin variousgroups

綜上所述，PMOP發(fā)生后補充雌二醇可以減弱PMOP中骨轉(zhuǎn)換加速，在一定程度上增強骨形成并抑制骨吸收從而平衡骨代謝，而雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3治療后能更加明顯促進成骨細胞的增殖和成骨活性，從而延緩PMOP的發(fā)生。臨床中可以以低劑量雌二醇聯(lián)合1，25（OH）2D3治療PMOP，降低過量激素替代導致的不良反應發(fā)生率。