血管緊張素(1-7)對(duì)小鼠肢體缺血再灌注所致腎損傷的改善作用及其機(jī)制

朱麗艷,王耀明,秦 政,趙歡歡,王增穎,楊秀紅

（1.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山063000；2.河北省唐山市慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山063000）

肢體缺血再灌注（limb ischemia-reperfusion，LIR）是骨科手術(shù)和血管創(chuàng)傷等臨床中極為常見(jiàn)的病理生理過(guò)程，其發(fā)生后可導(dǎo)致多臟器功能障礙，較為嚴(yán)重的LIR可以誘發(fā)急性腎功能障礙［1］，但具體作用機(jī)制尚未完全明確。本課題組前期研究［2］顯示：LIR后存在腎素-血管緊張素系統(tǒng)（reninangiotensin system，RAS）過(guò)度激活，并且腎組織局部RAS穩(wěn)態(tài)失衡參與了遠(yuǎn)隔組織器官損傷的發(fā)生發(fā)展。已有研究［3-5］表明：在慢性腎臟疾病、梗阻性腎病和糖尿病腎病等疾病中血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）參與了腎臟纖維化及腎損傷的炎癥反應(yīng)，血管緊張素（1-7）［angiotensin-（1-7），Ang-（1-7）］能夠通過(guò)激活Mas受體抑制Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）信號(hào)通路和核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)通路以及減弱Janus酪氨酸蛋白激酶2（Janus kinase-2，JAK 2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT 3）炎癥介導(dǎo)途徑拮抗AngⅡ介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而Ang-（1-7）在C57BL/6小鼠LIR后腎損傷中炎癥反應(yīng)中的作用尚不明確。本研究通過(guò)觀察外源性Ang-（1-7）干預(yù)LIR小鼠對(duì)腎損傷和腎組織中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及NF-κB表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討Ang-（1-7）在LIR致腎損傷中的作用及其可能的炎癥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器清潔級(jí)C57BL/6小鼠30只，10周齡，雄性，體質(zhì)量25～30 g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，在華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得華北理工大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。Ang-（1-7）（南京肽業(yè)生物科技有限公司），Ang-（1-7）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司），兔抗NF-κB p65抗體（上海創(chuàng)亞化工有限公司），兔抗Mas受體抗體（北京傲銳東源生物科技有限公司），兔抗β-actin抗體（美國(guó)ABclonal公司），免疫組織化學(xué)染色試劑（北京中杉金橋公司），血清肌酐（serum creatinine，Scr）和 尿 素 氮（blood urea nitrogen，BUN）檢測(cè)試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司），ECL發(fā)光劑、山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑、RIPA組織蛋白裂解液和彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（碧云天生物技術(shù)研究所）。iMark酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司），微量滲透泵1002型（美國(guó)Alza公司），全自動(dòng)生化分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。

1.2 LIR模型制備小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、LIR組和LIR+Ang-（1-7）組，每組10只。LIR組和LIR+Ang-（1-7）組小鼠于制備模型前行滲透泵皮下置入術(shù)：嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)埋置生理鹽水和Ang-（1-7）的 微 量 滲 透 泵（24μg·kg－1·h－1）持 續(xù)14 d，所有操作均嚴(yán)格按照外科無(wú)菌術(shù)原則，術(shù)后將動(dòng)物置于37℃恒溫?zé)釅|上直至蘇醒。LIR組和LIR+Ang-（1-7）組小鼠建立LIR模型：小鼠腹腔注射3%水合氯醛（3 mg·kg－1）麻醉，雙后肢根部行橡皮套結(jié)扎術(shù)，缺血2 h后用手術(shù)剪剪斷橡皮圈，雙手按摩雙側(cè)后肢血流進(jìn)行血流灌注4 h。麻醉狀態(tài)下摘眼球處死小鼠，收集血漿和雙側(cè)腎組織，腎組織分別于甲醛固定液和－80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小鼠腎功能指標(biāo)檢測(cè)各組小鼠血清離心并取上清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清中Scr和BUN水平。

1.4 HE染色觀察小鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)將一側(cè)小鼠腎組織浸泡于10%甲醛中，常規(guī)病理組織切片制備，HE染色，光鏡下觀察腎組織組織病理形態(tài)表現(xiàn)。根據(jù)腎小管間質(zhì)半定量評(píng)分法對(duì)腎炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腎間質(zhì)水腫和腎小管損傷分別進(jìn)行半定量分析的標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分［6］，即腎組織病理?yè)p傷評(píng)分：腎小管上皮細(xì)胞扁平化的存在（1分），小管刷狀緣消失（1分），細(xì)胞膜泡出現(xiàn)（1分或2分），間質(zhì)水腫（1分），胞漿空泡化（1分），細(xì)胞壞死（1分或2分），管腔梗阻出現(xiàn)管型或碎片（1或2分），正常腎小管為0分。每張組織切片鏡下選10個(gè)區(qū)域的100個(gè)完整的腎小管進(jìn)行評(píng)分，最高為10分取平均值。

1.5 ELISA法檢測(cè)小鼠腎組織和血清中Ang-（1-7）水平剪取適量腎組織，稱(chēng)質(zhì)量；放置在預(yù)冷PBS緩沖液中清洗，去除組織中血液；按組織與PBS緩沖液的質(zhì)量體積比為1∶10加入PBS緩沖液；剪碎，超聲勻漿，置于－20℃過(guò)夜，反復(fù)凍融2次，將組織勻漿4℃、5 000 r·min－1離心5 min，取上清；取全血標(biāo)本4℃過(guò)夜放置，4℃、1 000 r·min－1離心15 min，取上清；按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)A值和濃度曲線(xiàn)計(jì)算小鼠腎組織和血清中Ang-（1-7）水平。

1.6 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)小鼠腎組織中NF-κB、TNF-α和Mas受體蛋白表達(dá)分布情況和表達(dá)水平應(yīng)用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法（SP法），按免疫組織化學(xué)試劑說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，NF-κB一抗稀釋濃度為1∶200，TNF-α一抗稀釋濃度為1∶100，Mas受體一抗稀釋濃度為1∶100，封片后鏡下分別觀察NF-κB、TNF-α和Mas受體蛋白表達(dá)分布情況，采用專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件Image ProPlus 6.0選取圖片上具有染料色調(diào)的區(qū)域，檢測(cè)該區(qū)域累計(jì)光密度（integrated option density，IOD）值，選擇并測(cè)量有效統(tǒng)計(jì)區(qū)域的面積，同時(shí)計(jì)算IOD平均值（IOD/area），代表目的蛋白表達(dá)水平。

1.7 Western blotting法檢測(cè)小鼠腎組織中NF-κB、TNF-α和Mas受體蛋白表達(dá)水平稱(chēng)取適量腎組織研磨，加入預(yù)冷的蛋白裂解液，采用冰上超聲勻漿，4℃、12 000 r·min－1離心15 min，取上清。BCA法測(cè)定上清液中的蛋白濃度，將蛋白濃度用RIPA調(diào)整為5 g·L－1，按4∶1比例與5×上樣緩沖液混勻，煮沸10 min；10%SDS-PAGE電泳，90 V轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（NF-κB抗體1∶1 500，TNF-α抗體1∶1 000，Mas受體抗體1∶1 000，β-actin抗體1∶10 000）4℃冰箱孵育過(guò)夜，次日TBST洗膜4次，每次10 min，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜4次，每次10 min。ECL發(fā)光劑顯影、成像，以β-actin作為內(nèi)參，利用Image J軟件分析處理?xiàng)l帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠血清中SCr和BUN水平，腎組織病理?yè)p傷評(píng)分，腎組織中Ang-（1-7）水平及NF-κB、TNF-α和Mas受體蛋白表達(dá)水平，均以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠腎功能指標(biāo)與對(duì)照組比較，LIR組小鼠血清中SCr和BUN水平明顯升高（P＜0.05）；與LIR組比較，LIR+Ang-（1-7）組小鼠血清中SCr和BUN水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠腎功能指標(biāo)和腎組織病理?yè)p傷評(píng)分Tab.1Indexes of kidney function and pathological injury scores of kindey tissue of mice in various groupsn=10，±s）

表1 各組小鼠腎功能指標(biāo)和腎組織病理?yè)p傷評(píng)分Tab.1Indexes of kidney function and pathological injury scores of kindey tissue of mice in various groupsn=10，±s）

*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs LIR group.

Group Control LIR LIR+Ang-(1-7)Scr[c B/(μmol·L－1)]19.92±1.96 30.35±5.09*24.94±2.72△BUN[c B/(mmol·L－1)]7.95±2.06 13.36±2.45*9.91±1.69△Pathological injury score 14.67±3.54 55.20±9.13*36.80±4.02△

2.2 各組小鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)和腎組織病理?yè)p傷評(píng)分光鏡下觀察，對(duì)照組小鼠腎組織中腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與對(duì)照組比較，LIR組小鼠腎組織損傷嚴(yán)重，可見(jiàn)腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，腎小管管腔明顯擴(kuò)張，出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞水腫和脫落，部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、壞死，腎間質(zhì)存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分?jǐn)U張的管腔見(jiàn)大量上皮細(xì)胞碎片和紅細(xì)胞管型，腎組織病理?yè)p傷評(píng)分明顯升高（P＜0.05）；與LIR組比較，LIR+Ang-（1-7）組小鼠腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張充血減輕，偶見(jiàn)腎小管管腔擴(kuò)張、腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和腎小管上皮細(xì)胞碎片等損傷表現(xiàn)，腎組織病理?yè)p傷評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1和表1。

圖1 各組小鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)(HE,×200)Fig.1Pathomorphology of kidney tissue of mice in various groups（HE,×200）

2.3 各組小鼠腎組織和血清中Ang-（1-7）水平與對(duì)照組比較，LIR組小鼠腎組織和血清中Ang-（1-7）水平明顯降低（P＜0.05）；與LIR組比較，LIR+Ang-（1-7）組小鼠腎組織和血清中Ang-（1-7）水平明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠腎組織和血清中Ang-(1-7)水平Tab.2Levels of Ang-(1-7)in kidney tissue and serum of mice in various groupsn=10，±s）

表2 各組小鼠腎組織和血清中Ang-(1-7)水平Tab.2Levels of Ang-(1-7)in kidney tissue and serum of mice in various groupsn=10，±s）

*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs LIR group.

Group Control LIR LIR+Ang-(1-7)Ang-(1-7)Kindey tissue[w B/(ng·g－1)]14.05±1.44 11.99±1.29*16.53±3.15△Serum[c B/(mmol·L－1)]1.76±0.13 1.39±0.29*2.10±0.29△

2.4免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組小鼠腎組織中NF-κB、TNF-α和Mas受體蛋白表達(dá)分布和表達(dá)水平NF-κB、TNF-α及Mas受體蛋白均主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，腎小球中有少量表達(dá)。與對(duì)照組比較，LIR組小鼠腎組織中NF-κB、TNF-α和Mas受體蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與LIR組比較，Ang-（1-7）組小鼠腎組織中NF-κB和TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Mas受體蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2和表3。

表3 各組小鼠腎組織中TNF-α、NF-κB和Mas受體蛋白表達(dá)水平Tab.3Expression levelsof TNF-α,NF-κB,and Masreceptor proteins in kidney tissue of mice in various groups（n=10，±s）

表3 各組小鼠腎組織中TNF-α、NF-κB和Mas受體蛋白表達(dá)水平Tab.3Expression levelsof TNF-α,NF-κB,and Masreceptor proteins in kidney tissue of mice in various groups（n=10，±s）

*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs LIR group.

Group Control LIR LIR+Ang-(1-7)TNF-α 0.08±0.02 0.21±0.03*0.13±0.02△NF-κB 0.10±0.01 0.22±0.02*0.19±0.02△Mas receptor 0.16±0.01 0.21±0.01*0.28±0.01△

圖2 各組小鼠腎組織中TNFα、NF-κB和Mas受體蛋白表達(dá)情況（免疫組織化學(xué),×200）Fig.2Expressions of TNF-α,NF-κB,and Mas receptor proteins in kidney tissue of mice in various groups（Immunohistochemistry,×200)

2.5 Westernblotting法檢測(cè)各組小鼠腎組織中NF-κB、TNF-α和Mas受體蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，LIR組小鼠腎組織中NF-κB、TNF-α和Mas受體蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與LIR組比較，LIR+Ang-（1-7）組小鼠腎組織中NF-κB和TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Mas受體蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠腎組織中NF-κB、TNF-α和Mas受體蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B-D）Fig.3 Electrophoregram(A)and histogram(B-D)of expressions of NF-κB,TNF-αand Mas receptor proteins in kidney tissue of mice in various groups

3 討 論

急性腎損傷是缺血再灌注損傷最為嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其發(fā)病率和死亡率逐年升高，但其確切機(jī)制尚不清楚。大量研究［7-9］已經(jīng)證實(shí)：在RAS作用相反的2條軸中，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）-AngⅡ-血管緊 張 素Ⅱ1型受體（angotensinⅡtype 1 receptor，AT 1）是引起腎損傷的重要因素，而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）-Ang-（1-7）-Mas軸在參與調(diào)節(jié)腎組織的氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化等多種病理生理學(xué)過(guò)程中起拮抗作用。

TNF-α是參與炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，NF-κB是炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可上調(diào)炎癥基因產(chǎn)物，在炎癥中扮演重要的角色，炎癥因子的表達(dá)水平能夠反映LIR時(shí)組織損傷的嚴(yán)重程度。研究［10-12］顯示：缺血再灌注損傷的病理過(guò)程中，AngⅡ可通過(guò)AT 1受體誘導(dǎo)休克動(dòng)物TNF-α和NF-κB的激活而啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致水鈉潴留及腎小管上皮增生等，最終誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，加重缺血再灌注損傷，而針對(duì)RAS靶向軸的阻斷多能夠抑制腎組織損傷的病變程度。有研究［13］表明：Ang-（1-7）可明顯降低Alport綜合征小鼠TNF-α和單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）等炎癥因子和黏附分子水平，并上調(diào)ACE2的表達(dá)，從而延緩Alport綜合征小鼠腎病的進(jìn)展。研究［14］顯示：應(yīng)用Ang-（1-7）治療后，通過(guò)降低TNF-α和IL-6的表達(dá)水平可使ACE2敲除肥胖小鼠炎癥表現(xiàn)明顯改善。研究［15-16］顯示：長(zhǎng)期慢性輸注Ang-（1-7）能夠降低急性缺血再灌注導(dǎo)致的NF-κB活性增強(qiáng)和IL-1和IL-6的表達(dá)，Ang-（1-7）能夠減輕瘦素缺乏db/db小鼠的腎臟質(zhì)量、腎小球系膜擴(kuò)張和尿白蛋白排泄，表明Ang-（1-7）在炎癥反應(yīng)過(guò)程中具有一定的炎癥抑制作用。Ang-（1-7）可以刺激內(nèi)皮型一氧化氮合酶磷酸化，抑制磷酸肌醇激酶途徑，從而增加一氧化氮（NO）和前列環(huán)素釋放，減少TNF-α等炎癥因子的釋放［17］。研究［18-20］顯示：長(zhǎng)期輸注Ang-（1-7）能夠降低AngⅡ水平，發(fā)揮AT 1的生理拮抗作用。Ang-（1-7）可以通過(guò)抑制Mas受體降低AngⅡ所致的人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成和TNF-α等炎癥因子表達(dá)，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。NIE等［21］研究顯示：Ang-（1-7）能夠通過(guò)作用Mas受體增加抗炎因子的產(chǎn)生，抑制Th1細(xì)胞分化，減少促炎因子的產(chǎn)生。JIANG等［22］也已證實(shí)：Mas受體的激活明顯抑制了磷酸化核因子κB抑制蛋白α（NF-kappa-B inhibitor alpha，IKBα）和NF-κB p65的增加。長(zhǎng)期輸注AngⅡ，ACE2和Mas雙重缺失小鼠NF-κB炎癥信號(hào)可明顯激活，促進(jìn)炎癥及纖維化等腎臟損傷［23］。推測(cè)Mas受體在LIR造成的腎損傷炎癥作用中可能起到保護(hù)作用。本課題組前期研究［24］顯示：LIR后急性腎損傷與局部組織RAS失衡有密切關(guān)聯(lián)，但Ang-（1-7）是否可通過(guò)降低LIR后炎癥因子而減輕腎臟損傷尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示：LIR組小鼠腎組織中NF-κB、TNF-α和Mas受體蛋白表達(dá)水平明顯升高，血清中Scr和BUN水平明顯升高，腎組織中腎小球和腎小管等出現(xiàn)相應(yīng)的病理變化，同時(shí)LIR組小鼠腎臟組織及血清中Ang-（1-7）水平降低，說(shuō)明LIR組小鼠在LIR后腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，但LIR+Ang-（1-7）組 小 鼠 腎 臟 炎 癥 因 子（NF-κB、TNF-α）水平和血清中Scr及BUN水平明顯降低，腎組織中Mas受體蛋白表達(dá)水平明顯升高，推測(cè)在ACE2-Ang-（1-7）-Mas保護(hù)性通路中，Ang-（1-7）可能通過(guò)增加Mas受體表達(dá)水平，間接拮抗AngⅡ水平，并增加抗炎因子和減少促炎因子的產(chǎn)生，從而對(duì)LIR誘導(dǎo)的腎臟損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，Ang-（1-7）在C57BL/6小鼠LIR造成的腎損傷的炎癥反應(yīng)中可能具有降低NF-κB和TNF-α水平從而減輕腎臟損傷的作用，但其具體抑制炎癥反應(yīng)的通路仍需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為解決LIR腎損傷抗炎藥物的研究提供了新的思路。