金雀異黃酮通過(guò)調(diào)控Ca2＋-CaMKIV通路對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用

高華武，王 艷，周 鵬，葉 樹(shù)，宋 航，汪光云，蔡 標(biāo),*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種與年齡相關(guān)的慢性、神經(jīng)退行性疾病，伴隨著記憶缺失和認(rèn)知功能障礙，并最終會(huì)導(dǎo)致患者死亡。AD是誘發(fā)進(jìn)行性癡呆的主要病因之一，據(jù)估計(jì)，目前中國(guó)有1 000萬(wàn)AD患者，美國(guó)有580萬(wàn)AD患者，到21世紀(jì)中葉，全球癡呆患者將達(dá)到1.52億，其中約60%～70%為AD患者[1-2]。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今臨床上常用的抗AD藥物效果不理想，從天然產(chǎn)物及其衍生物中研制抗AD的新型藥物已成為研發(fā)的重要方向，并且眾多研究結(jié)果證實(shí)天然產(chǎn)物及其衍生物在改善AD進(jìn)程方面具有很好的療效[3-4]。

金雀異黃酮（genistein，GS），化學(xué)名稱為4’,5,7-三羥異黃酮，是大豆異黃酮的主要成分，約占大豆中總異黃酮的60%[5]，廣泛存在于大豆、玉米、大麥、小麥、黑麥等各種可食用的植物中，在大豆中最為豐富[6]。金雀異黃酮在化學(xué)結(jié)構(gòu)上類似于17-β-雌二醇，有研究用金雀異黃酮模擬雌激素與其受體結(jié)合，發(fā)現(xiàn)其可在靶器官中發(fā)揮雌激素作用，但沒(méi)有雌激素的不良反應(yīng)[6-8]，對(duì)更年期癥狀和更年期相關(guān)疾病，如骨質(zhì)疏松癥、肥胖癥、糖尿病、焦慮癥、抑郁癥和乳腺癌等[5,9-10]有很好的療效。在AD防治方面，金雀異黃酮可以縮短AD模型動(dòng)物逃避潛伏期和降低錯(cuò)誤次數(shù)，改善學(xué)習(xí)記憶能力，改善大腦功能[11-12]，其機(jī)制可能與減少β淀粉樣蛋白（beta amyloid peptide，Aβ）沉積、抑制細(xì)胞凋亡、減少氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥、誘導(dǎo)自噬等途徑等有關(guān)[13-15]，但是金雀異黃酮的作用機(jī)制仍然有待進(jìn)一步研究。

研究表明，Ca2＋-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶IV（calmodulin-dependent protein kinase IV，CaMKIV）信號(hào)通路在AD的發(fā)病中起著重要的作用。Aβ在神經(jīng)元細(xì)胞中的沉積導(dǎo)致Ca2＋濃度增加，超載的Ca2＋和鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）的結(jié)合激活了鈣-鈣調(diào)素復(fù)合物（Ca2＋/CaM）的活性。進(jìn)入細(xì)胞核后，Ca2＋/CaM激活鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶（calcium/calmodulin dependent protein kinase kinase，CaMKK）及其底物CaMKIV促使環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）激酶磷酸化，進(jìn)而磷酸化Tau，過(guò)度磷酸化的Tau蛋白是異常神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）的主要組成部分，是AD臨床表達(dá)的重要因素。因此，通過(guò)CaM-CaMKIV信號(hào)通路抑制Tau蛋白過(guò)磷酸化是預(yù)防和治療AD的重要方法[16-17]。本實(shí)驗(yàn)用Aβ25-35誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷建立AD細(xì)胞模型，以抑制Ca2＋超載和介導(dǎo)Ca2＋-CaMKIV信號(hào)通路為切入點(diǎn)，觀察金雀異黃酮對(duì)海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，探討金雀異黃酮對(duì)海馬神經(jīng)元保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級(jí)24 h內(nèi)新生SD乳鼠（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（皖）2017-001），雌雄各半，購(gòu)自安徽省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物飼養(yǎng)于安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，控制室溫18～25 ℃、相對(duì)濕度40%～70%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置已通過(guò)安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

金雀異黃酮（純度≥98%，批號(hào)：C1431028） 上海Aladdin公司；戊酸雌二醇（estradiol valerate，EV）片（批號(hào)：185A） 法國(guó)DELPHARM Lille S.A.S公司；Aβ25-35（批號(hào)：095M4775V） 美國(guó)Sigma公司；Hoechst 33258 上海百豪生物科技有限公司；抗MAP-2的小鼠抗體（1∶200）、Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig）G抗體（1∶200） 北京Bioss公司；Hoechst 33258（5 μg/mL） 上海Beyotime公司；CaM、CaMKK抗體 英國(guó)Abcam公司；CaMKIV、tau抗體 美國(guó)Cell Signaling technology公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BD C6流式細(xì)胞儀 美國(guó)Becton Dickinson公司；FluorChem M凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)ProteinSimple公司；042BR12088電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；IX81倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；AE2000倒置顯微鏡 廈門Motic公司；多功能酶標(biāo)儀 上海沛歐分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)

取新生SD乳鼠，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液中浸泡20 s消毒后頸椎脫臼處死，剝離海馬組織，用0.125%（體積分?jǐn)?shù)，下同）胰酶消化20 min，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打形成細(xì)胞懸液，200 目篩過(guò)濾后，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，在沉淀中加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打均勻后，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106cells/mL，然后接種至由多聚賴氨酸覆蓋的細(xì)胞板中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)基在24 h后更換為神經(jīng)元培養(yǎng)液（100 mL neurobasal-A＋2 mL B27＋252 μL 0.2 mol/LL-谷氨酰胺），之后每隔3 d換1/2體積培養(yǎng)液。在培養(yǎng)期間，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.3.2 神經(jīng)元的免疫熒光法鑒定

細(xì)胞爬片用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L pH 7.4，下同）浸洗2 次，加入4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)多聚甲醛固定30 min，PBS浸洗3 次，每次5 min。加3%山羊血清溫育30 min阻斷非特異性反應(yīng)性，加入兔抗MAP-2（1∶200），并放入濕盒，在4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3 次后，加Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶200），濕盒中37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3 次，加入Hoechst 33258染色液，染色10 min，用PBS洗滌3 次。利用抗猝滅封片液封片，隨后在倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組、造模和干預(yù)

根據(jù)本課題組海馬神經(jīng)元損傷模型方法[18]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，乳鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞按1×106cells/mL濃度加入96 孔板中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將細(xì)胞分為4 組：空白對(duì)照組、模型組、GS組和陽(yáng)性對(duì)照EV組，除空白對(duì)照組外，其他組神經(jīng)元加入含有Aβ25-35的培養(yǎng)基（30 μmol/L）孵育24 h，建立海馬神經(jīng)元損傷模型；在造模前，GS和EV組分別用50 μmol/L金雀異黃酮和10 μmol/L EV預(yù)處理3 h，空白對(duì)照組加入新鮮神經(jīng)元培養(yǎng)液100 μL。

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

1.3.4.1 MTT法檢測(cè)海馬神經(jīng)元存活率

神經(jīng)元經(jīng)過(guò)造模和干預(yù)后，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，棄去培養(yǎng)液，加PBS潤(rùn)洗2 遍，每孔加入20 μL 5 mg/mL的四甲基偶氮唑藍(lán)（methylthiazolyl tetrazolium，MTT），孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。按下式計(jì)算神經(jīng)元存活率。

1.3.4.2 熒光探針檢測(cè)海馬神經(jīng)元Ca2＋熒光強(qiáng)度

熒光探針fluo-3 AM用無(wú)Ca2＋細(xì)胞外液（135 mmol/L NaCl、2 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、10 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、4 g/L葡萄糖）稀釋成工作濃度5 μmol/L。神經(jīng)元經(jīng)過(guò)造模和干預(yù)后，孵育24 h，每孔加入1 mmol/L fluo-3 AM 5 μL，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3 次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋熒光強(qiáng)度（以發(fā)出熒光細(xì)胞的比例計(jì)）。

1.3.4.3 Western blot測(cè)定海馬神經(jīng)元相關(guān)蛋白的表達(dá)

神經(jīng)元經(jīng)過(guò)造模和干預(yù)后，孵育24 h，棄上清液，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)總蛋白質(zhì)量濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（CaM、CAMKK（1∶1 000）、p-CAMKIV（1∶800）、p-Tau（1∶600）），4 ℃過(guò)夜，Tris-HCl緩沖液（含1% Tween 20）洗滌3 次，加入山羊抗兔IgG（1∶20 000），室溫下孵育1.5 h，TBST洗滌3 次。使用電化學(xué)發(fā)光劑，凝膠成像儀拍照和半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。以β-actin作為內(nèi)參。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

選用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較，方差齊采用最小顯著性差異（least significance difference，LSD）法，方差不齊采用Dunnett’s檢驗(yàn)，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代海馬神經(jīng)元的鑒定結(jié)果

免疫熒光法鑒定海馬神經(jīng)元。微管相關(guān)蛋白-2（microtubule-associated protein，MAP-2）是一種神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞骨架蛋白，在成熟和未成熟的神經(jīng)元中都有表達(dá)，主要在樹(shù)突和細(xì)胞體中。MAP-2可以用來(lái)識(shí)別神經(jīng)元。海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7 d后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，圖1A紅色熒光為MAP-2，圖1B顯示藍(lán)色熒光是被Hoechst 33258標(biāo)記的細(xì)胞核，圖1C為圖1A和圖1B的疊加效果。檢測(cè)結(jié)果表明MAP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為90%以上，海馬神經(jīng)元細(xì)胞分離成功。

圖1 原代海馬神經(jīng)元的鑒定結(jié)果Fig. 1 Identification of primary hippocampal neurons

2.2 金雀異黃酮對(duì)神經(jīng)元損傷模型中神經(jīng)元存活率的影響

MTT法檢測(cè)各組神經(jīng)元存活率，結(jié)果見(jiàn)圖2。神經(jīng)元經(jīng)Aβ25-35處理后，模型組神經(jīng)元存活率為50.4%，與空白對(duì)照組相比極顯著降低（P＜0.01），表明造模成功；GS組、陽(yáng)性對(duì)照EV組神經(jīng)元存活率分別為92.4%、73.1%，與模型組相比神經(jīng)元存活率極顯著提高（P＜0.01）。

圖2 金雀異黃酮對(duì)神經(jīng)元損傷模型中神經(jīng)元存活率的影響Fig. 2 Effect of genistein on neuron survival rate in neuron injury model

2.3 金雀異黃酮對(duì)神經(jīng)元損傷模型中細(xì)胞Ca2＋熒光強(qiáng)度的影響

熒光探針技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋熒光強(qiáng)度。圖3結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組神經(jīng)元的Ca2＋綠色熒光強(qiáng)度極顯著提高（P＜0.01）；與模型組相比，GS組神經(jīng)元Ca2＋綠色熒光強(qiáng)度極顯著降低（P＜0.01），陽(yáng)性對(duì)照EV組神經(jīng)元Ca2＋綠色熒光強(qiáng)度有一定程度降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 金雀異黃酮對(duì)神經(jīng)元損傷模型中細(xì)胞Ca2＋熒光強(qiáng)度的影響Fig. 3 Effect of genistein on intracellular Ca2+ fluorescence intensity in neuron injury model

2.4 金雀異黃酮對(duì)神經(jīng)元損傷模型中細(xì)胞CaM、CaMKK、p-CaMKIV蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)得到的Ca2＋-CaMKIV通路相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖4。與空白對(duì)照組比較，模型組神經(jīng)元CaM、CaMKK、p-CaMKIV蛋白表達(dá)極顯著升高；與模型組比較，GS和陽(yáng)性對(duì)照EV組CaM、CaMKK、p-CaMKIV蛋白表達(dá)極顯著降低（P＜0.01）。

圖4 金雀異黃酮對(duì)神經(jīng)元損傷模型中細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of genistein on the expression of cell-related proteins in neuronal injury model

2.5 金雀異黃酮對(duì)神經(jīng)元損傷模型中p-Tau蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)p-Tau蛋白的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖5。與空白對(duì)照組比較，模型組神經(jīng)元p-Tau蛋白相對(duì)表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，GS和EV組p-Tau蛋白相對(duì)表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01）。

圖5 金雀異黃酮對(duì)神經(jīng)元損傷模型中細(xì)胞p-Tau蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of genistein on the expression of p-Tau protein in neuronal injury model

3 討 論

AD是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，海馬神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)和功能受損是AD的一個(gè)重要病理基礎(chǔ)[19]。海馬區(qū)Aβ沉積是老年斑形成的關(guān)鍵因素，老年斑引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載和產(chǎn)生大量自由基，進(jìn)而促進(jìn)了Tau蛋白過(guò)度磷酸化和NFTs，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元和神經(jīng)突觸丟失等病理改變[20-21]。金雀異黃酮是一種植物激素，富含于大豆類營(yíng)養(yǎng)食品，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注，具有改善更年期癥狀、預(yù)防骨質(zhì)疏松、降低乳腺癌發(fā)病率等功效，在AD防治方面具有潛力。前期研究發(fā)現(xiàn)，金雀異黃酮可能通過(guò)下調(diào)半胱氨酸蛋白酶-3、Bcl-2相關(guān)X蛋白和細(xì)胞色素c表達(dá)，抑制線粒體凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[22]；可能通過(guò)抑制蛋白激酶C通路，減少氧化應(yīng)激，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2＋水平，減少Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)毒性[23]。Aβ25-35為阿爾茨海默氏淀粉樣蛋白β肽鏈位于第25～35個(gè)氨基酸位點(diǎn)的基因片段，是引起神經(jīng)毒性的主要活性部位，是目前研究體外復(fù)制神經(jīng)元損傷模型的常用方法之一[24-25]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)免疫熒光鑒定結(jié)果表明，大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)成功。Aβ25-35作用于大鼠原代海馬神經(jīng)元24 h后經(jīng)MTT檢測(cè)，結(jié)果顯示Aβ25-35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元存活率極顯著降低，神經(jīng)元損傷模型成功建立；預(yù)先給予金雀異黃酮干預(yù)后，可減輕Aβ25-35所致神經(jīng)元損傷，提高神經(jīng)細(xì)胞存活率，提示金雀異黃酮對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷模型具有很好的神經(jīng)保護(hù)作用。

Ca2＋是體內(nèi)最重要的元素之一，Ca2＋穩(wěn)態(tài)對(duì)于維持神經(jīng)細(xì)胞的正常生理功能具有重要意義。Ca2＋超載出現(xiàn)在AD病程進(jìn)展中甚至是AD病理改變?cè)缙赱26]，Aβ的沉積和Tau蛋白磷酸化會(huì)引起細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核Ca2＋超載，進(jìn)而激活一系列Ca2＋依賴性信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷模型Ca2＋熒光強(qiáng)度極顯著升高，金雀異黃酮預(yù)處理可極顯著降低神經(jīng)元Ca2＋熒光強(qiáng)度，其可能原因是金雀異黃酮抑制了細(xì)胞膜上電壓依賴的Ca2＋通道，Ca2＋內(nèi)流減少[27]，也可能是金雀異黃酮增強(qiáng)了Ca2＋誘導(dǎo)的Ca2＋-突觸結(jié)合蛋白等途徑的胞吐作用[28-29]，從而改善Ca2＋超載現(xiàn)象。

Ca2＋-CaMKIV信號(hào)通路在神經(jīng)元傳遞、突出可塑性、神經(jīng)細(xì)胞分化、認(rèn)知功能等方面具有重要作用[30-31]。Ca2＋-CaMKIV信號(hào)通路涉及Ca2＋、CaM、CaMKK和CaMKIV。神經(jīng)細(xì)胞過(guò)多的Ca2＋與CaM結(jié)合形成Ca2＋-CaM復(fù)合物，進(jìn)而激活下游底物CaMKK，引起CaMKIV的磷酸化。磷酸化的CaMKIV一方面促進(jìn)鈣依耐性突觸蛋白的磷酸化，導(dǎo)致突觸間囊泡運(yùn)輸受阻，影響了新的突觸形成，損害了突觸功能；另一方面，CaMKIV過(guò)度磷酸化促使Tau蛋白Thr181、Thr231、Ser396等多個(gè)位點(diǎn)激活，促進(jìn)Tau蛋白發(fā)生磷酸化。過(guò)度磷酸化的Tau蛋白由于不能與微管結(jié)合，容易引起自身聚集，進(jìn)而形成雙股螺旋纖維，最終形成NFTs，導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡[16-17,32-33]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷模型CaM、CaMKK、p-CaMKIV以及p-Tau蛋白的表達(dá)均極顯著升高，而金雀異黃酮預(yù)處理可明顯減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷，降低損傷神經(jīng)元CaM、CaMKK、p-CaMKIV以及p-Tau蛋白的表達(dá)，提示金雀異黃酮可以下調(diào)Ca2＋-CaMKIV信號(hào)通路，減少Tau蛋白磷酸化。

綜上所述，金雀異黃酮可以減輕Aβ25-35對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的損傷，其機(jī)制可能與減少Ca2＋超載、抑制Ca2＋-CaMKIV信號(hào)通路、減少tau蛋白磷酸化有關(guān)，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究，以為未來(lái)植物激素防治AD研究提供選擇。