(＋)-兒茶素與表沒食子兒茶素沒食子酸酯對乙醇誘導HepG2細胞脂代謝紊亂及氧化應激的影響

胡博然，丁建才，曹 楊,，田 穎，國鳳華，袁 靜

（1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；2.首都兒科研究所，北京 100020；3.通化葡萄酒股份有限公司，吉林 通化 134002）

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，我國酒精飲料消費快速增長，人均飲酒量大幅增加。過量飲酒對人體具有一定程度的損害，進入人體的乙醇約有90%～95%在肝臟中代謝，乙醇對人體肝臟損害最為嚴重，這主要是乙醇及其衍生物在肝臟分解代謝過程中直接或間接誘導炎性介質(zhì)產(chǎn)生炎癥反應、氧化應激反應，進而通過氧化應激促使反應性氧化物增加，誘發(fā)肝臟脂肪聚集[1-2]。

兒茶素作為鞣質(zhì)的前體，廣泛分布于植物中，具有多種藥物活性成分，具有降血脂[3]、抗氧化[4]等的作用。(＋)-兒茶素（(＋)-catechin，(＋)-Cat）是兒茶素的異構(gòu)體之一，大多數(shù)研究集中在(＋)-Cat的提取鑒定、提取方法改進以及加工過程中兒茶素的穩(wěn)定性[5-7]方面，僅有少量文獻研究(＋)-Cat在降血脂[8]方面的作用。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中含量最為豐富、性質(zhì)最為活潑的兒茶素類物質(zhì)[9]。王艷等[10]研究發(fā)現(xiàn)EGCG能有效改善鏈脲佐菌素誘導的糖尿病SD大鼠的脂代謝紊亂。Santamarina等[11]研究發(fā)現(xiàn)EGCG通過調(diào)節(jié)肝臟線粒體呼吸鏈復合物，增加能量消耗，特別是脂質(zhì)底物的氧化，從而有助于預防肝脂肪變性。大部分報道針對EGCG對于高脂膳食或糖尿病模型下的大鼠或小鼠血脂的影響，對乙醇誘導下細胞的脂代謝紊亂的研究鮮見報道。所以，本實驗選擇兒茶素單體中的基礎(chǔ)構(gòu)型(＋)-Cat和兒茶素類物質(zhì)中抗氧化活性最強的單體EGCG，探究它們對乙醇誘導的細胞氧化應激及脂代謝紊亂的作用，同時對比它們的差異，以期為兒茶素及兒茶素類物質(zhì)在功能性食品開發(fā)方面提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、材料與試劑

HepG2肝癌細胞由中國人民解放軍疾病預防控制中心提供。

(＋)-Cat、EGCG 北京索萊寶科技有限公司；甘油三酯（triglycerides，TG）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、RNAprep Pure培養(yǎng)細胞總RNA提取試劑盒、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒 北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

090-135.001倒置顯微鏡 德國Leica公司；Spectra Max i3x光譜掃描多功能酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；CFX96 Touch實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乙醇作用濃度的確定

根據(jù)前人研究結(jié)果[12-13]，本實驗選擇乙醇作用濃度為300 mmol/L。

1.3.2 (＋)-Cat、EGCG作用濃度的確定

使用噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）法檢測細胞存活率[14]。96 孔板培養(yǎng)HepG2細胞，待細胞長滿板底后，按照濃度梯度分別向培養(yǎng)液中加入不同作用濃度（0、50、100、150、200、250、300 μmol/L）的(＋)-Cat或EGCG，以不添加(＋)-Cat或EGCG的正常培養(yǎng)基為對照組，每組6 個平行，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測細胞存活率以觀察(＋)-Cat、EGCG對細胞的毒性。

96 孔板培養(yǎng)HepG2細胞，待細胞長滿板底后，向培養(yǎng)液中加入不同作用濃度（0、50、100、150、200、250、300、350 μmol/L）的(＋)-Cat或EGCG和300 mmol/L的乙醇，每組6 個平行，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測細胞存活率以觀察(＋)-Cat、EGCG對抗乙醇毒性的作用。

細胞存活率測定：向待測孔中加入50 μL 5mg/mL MTT，在CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后吸棄上清液，加入150 μL二甲基亞砜，置于搖床處理10 min后，在酶標儀490 nm波長處測定每孔的OD值并按下式計算細胞存活率。

結(jié)合以上兩組實驗確定后續(xù)實驗所用的(＋)-Cat、EGCG作用濃度。

1.3.3 實驗分組

確定(＋)-Cat、EGCG作用濃度后，將實驗分為6 組：正常組（培養(yǎng)基不添加(＋)-Cat、EGCG和乙醇）、(＋)-Cat組、EGCG組、乙醇作用組（ETOH組）、乙醇和(＋)-Cat作用組（(＋)-Cat＋ETOH組）、乙醇和EGCG作用組（EGCG＋ETOH組）。培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期后，(＋)-Cat組、EGCG組、ETOH組分別在培養(yǎng)基中添加相應濃度的(＋)-Cat、EGCG以及乙醇，培養(yǎng)24 h。(＋)-Cat＋ETOH、EGCG＋ETOH組添加相應濃度乙醇培養(yǎng)24 h后，分別加入相應濃度的(＋)-Cat、EGCG繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.4 HepG2細胞TG含量、SOD活力、MDA濃度的檢測

HepG2細胞TG含量、SOD活力、MDA濃度分別參考其試劑盒說明書進行測定。

1.3.5 HepG2細胞脂代謝基因表達水平檢測

使用TRIzol法抽提細胞內(nèi)總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄酶對RNA進行反轉(zhuǎn)錄后，使用SYBR Green染料法及CFX96 Touch實時定量熒光PCR儀對目標基因進行擴增，采用2－ΔΔCT法計算各組HepG2細胞固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element binding protein 1，SREBP-1）、二脂酰甘油轉(zhuǎn)移酶2（diacylglyceryltransferase 2，DGAT2）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisomal proliferators activate receptors α，PPARα）、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1（carnityltransferase 1，CPT1）mRNA相對表達水平，相關(guān)基因引物序列詳見表1。

表1 擴增基因引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差形式表示。采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，各組間平均值的兩兩比較用獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 (＋)-Cat、EGCG作用濃度的確定

不同濃度的(＋)-Cat和EGCG作用于HepG2細胞24 h后的細胞毒性如圖1A所示，200 μmol/L (＋)-Cat和EGCG組細胞存活率較對照組顯著下降（P＜0.05）；250、300 μmol/L (＋)-Cat和EGCG組細胞存活率較對照組極顯著下降（P＜0.01），300 μmol/L EGCG已達到細胞的半數(shù)致死濃度；其余各組與對照組相比均無顯著變化（P＞0.05）。

圖1 MTT法檢測不同作用濃度(＋)-Cat、EGCG對HepG2細胞存活率的影響Fig. 1 Effects of (+)-Cat and EGCG on HepG2 cell survival detected by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay

(＋)-Cat和EGCG對乙醇誘導HepG2細胞存活率的影響分別如圖1B、C所示，不同濃度的(＋)-Cat和EGCG能夠減弱300 mmol/L乙醇誘導的細胞毒性作用。200、250 μmol/L (＋)-Cat組細胞存活率極顯著高于300 mmol/L乙醇組（P＜0.01）；200 μmol/L EGCG組細胞存活率極顯著高于300 mmol/L乙醇組（P＜0.01）。

綜合(＋)-Cat、EGCG對細胞的毒性作用以及二者抗乙醇毒性作用的結(jié)果，本研究選擇200 μmol/L作用濃度的(＋)-Cat和EGCG分析(＋)-Cat和EGCG對脂代謝紊亂和氧化應激的調(diào)節(jié)效果并比較二者的差異。

2.2 (＋)-Cat、EGCG對HepG2細胞TG含量的影響

如表2所示，與正常組相比，(＋)-Cat組及EGCG組的TG含量無顯著差異（P＞0.05），ETOH組TG含量顯著上升（P＜0.05），說明在乙醇的作用下，HepG2細胞脂代謝異常，造成TG的堆積。與ETOH組相比，(＋)-Cat＋ETOH組、EGCG＋ETOH組的TG平均含量顯著降低（P＜0.05），分別為ETOH組的63%和44%，說明(＋)-Cat與EGCG有效緩解了脂質(zhì)堆積，且EGCG的效果更好。

表2 (＋)-Cat、EGCG對HepG2細胞TG含量的影響Table 2 Effects of (+)-Cat and EGCG on TG content in HepG2 cells

2.3 油紅O染色觀察(＋)-Cat與EGCG對HepG2細胞脂滴的影響

通過油紅O染色可以直接觀察出細胞胞漿中脂滴的狀態(tài)。由圖2可知，ETOH組與正常組、(＋)-Cat組和EGCG組相比，可見較多的斑點狀紅色脂滴，說明乙醇誘導后的HepG2細胞出現(xiàn)脂質(zhì)積累；(＋)-Cat＋ETOH組和EGCG＋ETOH組與ETOH組相比，脂滴明顯減少，說明(＋)-Cat和EGCG的干預均可減輕乙醇誘導的HepG2細胞脂質(zhì)堆積。油紅O染色結(jié)果與TG含量檢測結(jié)果較為一致。Wu Qiong等[15]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG在一定甘油的作用下能抑制細胞內(nèi)的抑制3-羥基-3-甲基戊二?；o酶a還原酶活性，降低HepG2細胞內(nèi)的總膽固醇。Laura等[16]測試了郝靈普洱茶提取物和茶的主要成分EGCG對大鼠原代培養(yǎng)肝細胞的降脂效果，發(fā)現(xiàn)EGCG具有體外降脂作用。Roghani等[17]觀察慢性給藥EGCG對鏈脲佐菌素糖尿病大鼠脂質(zhì)和肝脂質(zhì)過氧化的影響，得出慢性EGCG治療糖尿病大鼠，可防止血糖和脂質(zhì)異常變化，降低肝脂質(zhì)過氧化。張聰?shù)萚3]以油酸孵育HepG2細胞24 h，建立體外高脂模型，在MTT實驗的基礎(chǔ)上，以脂質(zhì)清除率為指標，評價兒茶素的體外降脂效果，發(fā)現(xiàn)兒茶素能有效清除肝細胞內(nèi)堆積的脂肪，與本研究中的結(jié)果一致。

圖2 油紅O染色觀察(＋)-Cat、EGCG對HepG2細胞脂滴的影響（200×）Fig. 2 Oil red O staining observation of the effect of (+)-Cat and EGCG on lipid droplets in HepG2 cells (200 ×)

2.4 (＋)-Cat與EGCG對HepG2細胞脂代謝基因表達水平的影響

由圖3可知，與正常組相比，ETOH組SPEBP-1、DGAT2mRNA的相對表達量顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），分別為正常組的1.8 倍和1.4 倍；PPARα與CPT1mRNA相對表達量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），分別為正常組的30%和20%，說明乙醇影響了HepG2細胞脂代謝基因的正常表達。與ETOH組相比，(＋)-Cat＋ETOH組SPEBP-1、DGAT2mRNA的相對表達量顯著降低（P＜0.05），均約為ETOH組的80%；PPARα與CPT1mRNA相對表達量顯著升高（P＜0.05、P＜0.01），分別為ETOH組的2.4 倍和3.3 倍；EGCG＋ETOH組SPEBP-1、DGAT2mRNA的相對表達量顯著降低（P＜0.05）分別為ETOH組的69%和75%；PPARα與CPT1mRNA相對表達量顯著升高（P＜0.05）分別為ETOH組的2.1 倍和2.8 倍。說明(＋)-Cat和EGCG均能通過調(diào)節(jié)HepG2細胞脂代謝相關(guān)基因的表達，對乙醇誘導HepG2細胞脂代謝紊亂具有恢復作用，在相同濃度條件下EGCG的恢復效果更好。

圖3 (＋)-Cat、EGCG對 HepG2細胞脂代謝相關(guān)基因表達的影響Fig. 3 Effects of (+)-Cat and EGCG on the expression of lipid metabolism-related genes in HepG2 cells

2.5 (＋)-Cat與EGCG對HepG2細胞抗氧化酶SOD活力和脂質(zhì)過氧化物MDA濃度的影響

如表3所示，與正常組相比，EGCG組SOD活力顯著增加（P＜0.05），MDA濃度無顯著變化（P＞0.05）。ETOH組較正常組的SOD活力顯著降低（P＜0.05），為正常組的42%；MDA濃度顯著增加（P＜0.05），為正常組的1.7 倍。研究表明，過量飲酒導致機體發(fā)生氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生大量的活性氧，經(jīng)過脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生MDA，當MDA在機體內(nèi)上升時SOD清除自由基的能力相對下降[18]。ETOH組SOD活力降低、MDA濃度增加驗證了這一結(jié)論。(＋)-Cat＋ETOH組與EGCG＋ETOH組較ETOH組的MDA濃度顯著降低（P＜0.05），分別為ETOH組的37%和23%，SOD活力顯著提高（P＜0.05），分別為ETOH組的1.2 倍和1.4 倍。綜上可知(＋)-Cat、EGCG干預后可改善細胞內(nèi)的氧化應激狀態(tài)，增強抗氧化酶活性、減弱脂質(zhì)過氧化，其中EGCG的效果更好。

表3 (＋)-Cat、EGCG對HepG2細胞SOD活力和MDA濃度的影響Table 3 Effects of (+)-Cat and EGCG on SOD activity and MDA content in HepG2 cells

3 討 論

DGAT有兩個亞型（DGAT1與DGAT2），DGAT1主要負責組裝TG，DGAT2通過促進二酰基甘油和長鏈脂肪?；o酶A的鍵合來催化TG合成最后一步[19]。相對于DGAT1，DGAT2的表達在TG的合成中占有更重要的地位。初欣欣等[20]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)高脂飼料誘導后的金黃地鼠肝臟中，DGAT2基因表達量明顯升高，使得肝臟組織利用脂肪酸合成TG，使肝臟中TG的含量升高。宋芳等[21]研究發(fā)現(xiàn)乙醇誘導的脂肪肝大鼠中DGATmRNA的表達量明顯升高。本實驗中ETOH組細胞TG含量明顯高于正常組（P＜0.05），與乙醇誘導后細胞DGAT2mRNA的表達量升高有一定關(guān)系。(＋)-Cat、EGCG干預組TG含量較ETOH組低，說明(＋)-Cat、EGCG干預后下調(diào)DGAT2mRNA的表達，對降低TG合成起到了一定作用。

酒精性脂肪肝在組織病理學上主要表現(xiàn)為以TG為代表的中性脂肪在胞質(zhì)中大量蓄積。研究表明，酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展與腺苷酸蛋白活化激酶腺苷酸蛋白活化激酶介導的脂代謝通路受阻緊密相關(guān)。乙醇及其代謝產(chǎn)生的乙醛和活性氧等有害代謝物會不同程度地抑制肝臟腺苷酸蛋白活化激酶的活性，進而促進脂肪酸合成，抑制脂肪酸氧化，最終引起脂肪變性。SREBPs是肝臟中調(diào)節(jié)脂肪酸、TG和膽固醇的主要轉(zhuǎn)錄因子，包括3 種亞型（SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2）[22]。SREBP-1的過量表達會促進脂肪酸、TG的合成[23]。近年研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠激活腺苷酸蛋白活化激酶[24]，而腺苷酸蛋白活化激酶的激活可以抑制SPEBP-1信號的傳導[25]，從而降低SREBP-1mRNA的表達量，減少TG的合成。本實驗中EGCG干預組的SREBP-1mRNA表達量、TG含量較ETOH組低，與EGCG能夠激活腺苷酸蛋白活化激酶有關(guān)。(＋)-Cat干預組對下調(diào)SREBP-1mRNA的表達，減少TG的合成也有一定作用，但效果沒有EGCG干預組明顯。

過氧化物酶體增殖物激活受體對機體的生長發(fā)育及代謝有著重要的作用。PPARα是過氧化物酶體增殖物激活受體的亞型之一，能夠調(diào)節(jié)TG和脂肪酸氧化階段，促進脂肪酸向線粒體和過氧化物酶方向流動，促進脂肪酸氧化[26]。CPT1是脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶。PPARα的表達可以促進脂肪酸β氧化關(guān)鍵酶CPT1的表達，使得肝細胞脂肪酸氧化速率加快[27-28]。本研究中(＋)-Cat、EGCG干預組的PPARα和CPT1mRNA的表達量都較ETOH組高，同時干預組的TG含量較ETOH組低，說明(＋)-Cat、EGCG能上調(diào)PPARα和CPT1mRNA的表達，加快脂質(zhì)氧化。

研究表明細胞正常生理代謝過程中獲取的氧，98%轉(zhuǎn)化為能量，2%轉(zhuǎn)化為氧自由基，正常情況下體內(nèi)的天然抗氧化劑（SOD、谷胱甘肽等）會與氧自由基發(fā)生氧化還原反應，清除自由基，但長期大量飲酒會打破這一動態(tài)平衡，導致氧自由基大量增多，抗氧化物質(zhì)耗竭[29]。茶多酚被證實是有效的自由基清除劑，其中EGCG的還原電勢較低，抗氧化能力較強[30]。綠茶中的兒茶素尤其是EGCG能夠抑制活性氧的產(chǎn)生,達到抗氧化目的[31-32]。本研究中(＋)-Cat和EGCG均對乙醇誘導下細胞的氧化損傷有保護作用，且EGCG的干預效果更好，但具體機制還需進一步研究。

本實驗中，對乙醇誘導下HepG2細胞損傷，(＋)-Cat、EGCG均能降低TG和脂肪酸合成相關(guān)基因SREBP-1、DGAT2的表達，減少TG的合成；增加HepG2細胞中脂肪酸氧化基因PPARα和CPT1的表達，促進細胞脂肪酸氧化，減少脂質(zhì)積累；提高SOD活性，降低MDA濃度，改善細胞氧化應激狀態(tài)。EGCG對乙醇誘導下HepG2細胞的保護作用優(yōu)于(＋)-Cat。